γ—氨基丁酸在小儿难治性癫痫患者脑组织中表达和临床意义

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1、V—氨基丁酸在小儿难治性癫痫患者脑组织中表达和临床意义【摘要】目的：观察Y-氨基丁酸（Y-aniinobutyricacid,GABA）在难治性癫痫患儿脑组织中的表达，探索其在难治性癫痫发病机制中的作用。方法：15例患儿均来自福建医科大学附属医院南京军区福州总医院神经外科癫痫研究治疗中心，经PET/CT.MRI和VEEG及临床症候学评估等综合定位方法，确定致痫灶并行功能神经外科学手术治疗（实验组）和3例无癫痫病史的手术患儿（脑肿瘤2例,脑血肿1例）（对照组）脑组织。采用免疫组化的方法（pv-9000）标记两组标本中丫-氨基丁酸（GABA）能神经元,

2、于光镜（X200）下计数，对两组GABA能神经元个数进行比较,同时观察实验组颖叶皮层光镜（X100,X200）下其他病理组织学改变。结果：实验组与对照组比较，表达水平下降，差异具有统计学意义（P1.2研究方法实验组和对照组术中收集病灶脑组织标本，标本收集后置于10%多聚甲醛溶液中固定24〜48h,随后常规石蜡包埋，切片，常温保存备用。标本用病理科专用的石蜡切片机行冠状面连续切片，切片厚度为3um,每个标本分别切取10张切片，然后，将全部切片排序，每个标本随机抽取2张切片，分别行HE染色和免疫组织化学染色。免疫组织化学染色方法采用pv-9000法（二

3、步法免疫组化检测试剂），切片用二甲苯脱蜡水化，然后用乙醇去除二甲苯，放入0.3%过氧化氢溶液中室温条件下孵育20min,用以阻断内源性过氧化物酶的活性，提高抗原的活性。高温高压抗原热修复后，0.01mol/LPBS溶液（pH值7.2〜7.4）反复冲洗，然后加入10%正常山羊血清置37°C恒温水浴箱封闭抗原2h,甩去多余液体，不冲洗，滴加I抗小鼠抗人GAD67单克隆抗体1：500,购于北京博奥森公司，置于37°C室温下孵育1h；PBS清洗3次，每次3min。后续操作步骤严格按PV-9000采用免疫组织化学试剂盒说明书要求（购买于北京中杉金桥生物公司）

4、，滴加试剂IPolymerHelper（即用型），置于37°C室温下孵育20min,PBS清洗3次，每次3min，滴加试剂2（polyperoxidase-anti-mouse/rabbitlgG（即用型），置于37°C室温下孵育30min,PBS清洗3次，每次3min,暗室中DAB显色（用浓缩型DAB试剂盒）3〜5min,神经元染成棕褐色者为阳性细胞，蒸徭水冲洗终止反应，酒精脱水，二甲苯去除酒精，中性树脂封片。染成棕褐色的神经元为丫-氨基丁酸能神经元（又称阳性细胞）。颅内肿瘤切除术及颅内血肿清除术的患儿脑组织切片为对照组，分别滴加I抗、II抗进行

5、染色，方法同实验组。釆用彩色病理图像分析软件（MoticImagesAdvanced3.2）进行统计，在显微镜放大200倍的视野下，定位为脑组织皮质，然后在皮层的不同视野下分别选取3个不重叠视野，计算出每个视野中阳性细胞的个数，最后求取平均数，为该标本每视野阳性细胞个数。实验组HE染色观察光镜下皮层神经元形态。1.3统计学处理采用SPSS13.0软件进行数据统计分析，实验组和对照组比较采用两独立样本t检验，P随着对抗癫痫药物的临床应用，对GABA的储存、释放、降解有重要作用的GABA转运体(Y-aminobutyricacidtransporter

6、,GAT)引起了学者的广泛关注。GAT表达异常或功能受损是癫痫发作时神经元高兴奋性的原因之一。一般认为，人类颖叶癫痫患者脑组织的海马区GABA能中间神经元在显微镜下的病理变化为神经元出现破坏性病变，神经元出现缺失或减少，退变等形态结构的紊乱。这种神经元的破坏和减少可能是由于海马区GAT表达下降，对突触间隙GABA的摄取减少，从某种程度上讲是癫痫放电后引起的一种应激反应，但这是一种保护性反应。GAT表达下降可以起到一定的负反馈调节作用，使得增加GABA能神经元抑制作用［6］。进一步的研究已经证实，癫痫的发生不仅是由于兴奋性神经元作用的增强，而且也在于

7、抑制性神经元作用的减弱。其中抑制性神经元的减少在癫痫的发病机制中起着十分重要的作用。在目前的返回抑制学说研究中存在这样的两种理论，一种是谷氨酸能神经元，代表了兴奋性神经元，其存在于脑组织的海马的齿状回颗粒细胞，更能引起兴奋性作用增强的是存在于齿状回颗粒细胞中的苔状细胞；另一种是GABA能神经元，代表了抑制性神经元，其存在于脑组织的海马的齿状回颗粒细胞，但引起抑制性作用的是齿状回颗粒细胞中的篮状细胞；这两种细胞均起源于齿状回颗粒细胞。本研究的目的就是在于观察癫痫患者脑组织中GABA能神经元的表达如何，从而探讨其在癫痫发病中的影响作用。返回抑制学说认为

8、不论是感染还是外伤等，只要存在一定的刺激，并且这种刺激达到一定的刺激强度，作用于齿状回颗粒细胞，齿状回颗粒细胞受到刺激并且