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1、I型胶原c末端肽的检测方法和临床运用屮国骨质疏松朵志2000年第4期第6卷综述作者：冯晓丽张忠辉单位：冯晓丽(第三军医大学附二院内分泌科，重庆，400037)；张忠辉(第三军医大学附二院内分泌科，重庆，400037)I型胶原是人体最丰富的胶原蛋白形式，是佇中唯--的胶原成分，占骨棊质的90%以上。在忖组织佇基质的不断重建中，I型胶原被降解，小片段释放入血，部分出现于尿液中。测定血、尿屮这些小片段的含量和变化可评价骨吸收状态，既有助于代谢性骨病的诊断，也能监测和评价抗骨吸收约物的疗效。I熨胶原C末端肽(C—terminaltelopeptidesof
2、typeIcollagen,CTX),又称为Crosslaps,是这些小肽片段中的一•种。Bonde于1994年銓立CTX的检测方法［1］,并率先应川它作为骨吸收的指标。同传统的ft吸收指标尿拜脯氨酸(Hydroxyproline,Hpr)+ll比，CTX的检测有几个突出优点：①只来源于成熟胶原纤维，而不来源于新合成胶原；②在体内不被降解，也不被重新利川，能宜接反映胶原纤维的降解情况；③胶原饮食对测量结果无影响；④特异性强,灵敏；⑤检测方法简便。因ifUCTX的检测正取代尿拜脯氨酸被广泛地应用于临床和科研。本文就其检测方法和临床应用作一综述。1生化
3、特点完整的I型胶原C末端肽含有26个氨慕酸，其第15〜22个氨基酸依次为谷•赖•丙•组.犬冬•甘•甘•精氨酸(EKAHDGGR),这一部分对于I型胶原a1(1)链竣基末端具特界性，称为8氨酸序列［1］(8AA)o在体内，8AA中的天冬・廿氨酸残基肽链Z间口然地有由(】位向B位转化的趋势，从而形成B异构8AA(EKAH-0-DGGR),而口这种B异构形式为蛋口老化有关，其含量随竹中I型胶原分子老化的增加而增加［218AA的第二个氨棊酸赖氨酸参于胶原分子问交联一毗I定并嚇(Pyr)和脱氧毗唳并《tt(D・Pyr)交联的形成。由于8AA序列含分子间交联的
4、这一重耍区域，交联残基的接近和这些分子的紧密结构可保护含有这一序列的肽免受肾的进一步降解，因此由成熟I型胶原部分降解产生的CTX也可以在尿中检出［1］。CTX在尿中的排泄有昼夜节律改变，峰值在凌晨及下午最低［3］。血和尿中CTX稳定，在20C无任何防腐剂保存7天，或重复冻融标本5次，所测浓度无明显变化［1,6］。2检测方法血清和尿屮的CTX都能被测定。1994年，Bonde［1］首创尿CTX的酶联免疫吸附法(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA),称^CrosslapsELISAo该法用多克隆抗体测定，微孔板预
5、先以合成EKAHDGGR包被。测定时，微孔中加入标准殆或未加样品，然后加入兔抗8氨酸序列多克隆抗体，室温孵育1小时。洗孔，加入过氧化物酶结合山羊抗兔IgG,室温再孵育微孔板1小时。二次洗孔后，加底物溶液，即等量混合的过氧化氢和四甲基联苯胺，孵育15分钟，加磷酸终止反应，酶标仪测波长450nm条件下的吸光度。在半对数曲线图上，根据已知标准品浓度与其各口吸光度为横纵处标建立标准曲线，而未知样品的含量通过标准曲线内插法即可得出。为减少尿量为体型的影响，最后结果需以尿肌肝校止。此法批内和总的变异系数分别为5.3%和6.6%,测定范围0.5〜10.5mg/L
6、,检测限为0.2mg/Lo由于该CTX检测技术简便易行，结杲精确，所需吋间不超过3小吋，故很快应用于科研和临床。1997年，Fledelius［4］建立测定尿CTX的另一种酶联免疫吸附法一竞争性一步酶联免疫吸附法。该法用抗合成8AA单克隆抗体测定，以辣根过氧化物酶直接标记单抗。检测时,单抗与样品一•起加入到固定有8AA的微孔中，孵育1小时。洗孔后再依次加入底物溶液、终止液后测吸光度。样品中CTX含量与吸光度成反比。此种ELISA,检测范围为200〜7000mg/L,检测限为25mg/L,批内批间变异系数分别为5.5%、8.0%。虽然Fledeliu
7、s后来的研究表明，以上两种ELISA测尿中CTX有区别，前者测的是含有B异构8AA的CTX,而后者是含非B异构8AA的CTX［2］,但这两者的值高度相关(=0.93,n=158),而后者所需时间更短［4］。尿中CTX还可用RIA测定。这个测定用的是与來自I型胶原C末端肽的非B异构8AA序列起反应的单克隆抗体。测定前需以抗生物素链菌素包被试管，用1251标记抗8AA序列单抗作示踪剂。测定吋，试管内加入生物素结合的EKAHDGGR,在室温下孵冇15分钟，以使生物索结合的EKAHDGGR结合到不动的抗生物索链菌索。试管用缓冲液清洗后，依次加入样品、示踪剂
8、，同样条件下再孵冇3小吋。反应结束后，清洗试管，每个管的放射性用Y■计数器计数60秒。样本计数与CTX存在量成反比。该法测
