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1、青霉素结合蛋白测定技术探究作者：钱海伦查永喜余江河阎晓菊李广银【论文关键词】氛标记青霉素结合蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳荧光放射自显影【论文摘要】当前，细菌耐药性问题日趋严重，给临床治疗带来困难，对B-内酰胺类抗生素而言，某些菌青霉素结合蛋白(PBPs)改变造成的耐药性，是B-内酰胺类抗生素的特点。一般细菌的PBPs论文代写当前，细菌耐药性问题日趋严重，给临床治疗带来困难，对卜内駄胺类抗生素而言，某些菌青霉素结合蛋白(PBps)改变造成的耐药性，是卜内駄胺类抗生素的特点。一般细菌的PBPs均为胞浆膜上的蛋白质，是细菌致死的靶位。它的数目、位置、亲和力的变化造成与卜内駄胺类抗生素不
2、易结合而产生耐药性。人们常采用SDS聚丙烯駄胺凝胶电泳和放射自显影的方法研究PBPs图谱，以便了解敏感菌和耐药菌的区别。所以，PBPs测定技术是研究压内酸胺类耐药性的重要手段口］。的穿透力弱，用一般放射自显影法不能获得PBPs图谱，需采用荧光闪烁剂增效的“荧光放射自显影法”-国内有关PBps测定技术报道甚少，以3H标记者更少，本文介绍这一技术。论文代写1材料与方法1.1材料1.1.1菌种肺炎链球菌31003,30301（北京药品生物制品检定所;PenO8.R6本室保存菌种。1.1.2培养基C+Y培养基，参见文献（2）o论文代写1.1.3仅器及药品垂直板凝胶电泳槽（吴县科研仪
3、器厂）；NG—1型真空凝胶干燥器（太仓电视机厂）；TGLL-la型台式高速冷冻离心机（中科院上海生物化学研究所）;8438一超低温冰箱（FormaSclentifio,美国）；电泳仪DY—1型（上海医用分析仪器厂）；丙烯駄胺（Aerylamide,临海止学厂产）；甲撑双丙烯駄胺.（big；瑞士产品）；N,N,N,N—四甲基乙二胺（TEMED,上海前进农场制剂厂）；3H标记青霉素乙駄呱陡盐（NewEngiandNuclear,美国）；x光底片（天津感光材料厂；KodakDiangnostiefilmX一0matAR13X18em）；2,5一二苯基嗯哇（PP0,闪烁纯，上海试剂
4、一厂）；月桂駄肌氨酸钠（Sarkosyl,Sigma）；十二烷基硫酸钠（SDs,上海新华化工厂）;二甲基亚矶（DMso,北京旭东化工厂）。1.2方法1.2.1肺炎链球菌PBPs样品的制备将肺炎链球菌按种c+Y培养基37£过夜培养，次日再移种新鲜培养基中，37°C培养2~3h至对数生长期，菌数约为个/ml(CFU/ml),菌液分装试管，每管lml于冰浴中加入不同浓度的氛标记青霉素37£保温lOmin,在冰浴中加入5非标记青霉素G钠盐20万单位/ml,冷冻离心5000：/minlom仇，弃去上清，菌体沉淀用50以磷酸缓冲液(PH6.8)做成菌悬液，然后加入5—10拼一20%sa
5、rkosyl,37°C保温lOmin使细胞溶解，加入30协一样品缓冲液，煮沸3min,置室温备用。1.2.2聚丙烯就胺凝胶电泳釆用十二烷基硫酸钠一聚丙烯駄胺凝胶电泳(SDSPAGE)方法。制备凝胶薄片(厚0.2cm),凝胶配方：分离胶(10%):Aerylamide：bis(30:0.5)6.7ml,Tris(pH8.8,1.5ml/l)5ml,10%SDS0.2ml,蒸憎水8.1ml,真空搅拌10-15min除去气体，再加入TEMED,浓缩胶(5%)：按上述配方依次为1.7ml,2.5ml,0.1而，5.6ml,7.5,和150。先配制分离胶，灌注直立式电泳槽后，使凝胶凝
6、固。次日加入浓缩凝胶，放入加样梳，静置2ho在加样槽内依次分别加入PBps样品。接通电流，第一小时维持电压在60v,至染料前沿到达分离胶和浓缩胶交界处调高电压至120v,走完全程约需3一4h,用考马斯蓝R250染色30—45min,过夜脱色。1.2.3关光放射自显影方法凝胶片用二甲基亚矶(DMSo)处理30min,再用新鲜DMSo再次处理30而n,20%即。处理2—3h,1%甘油和1%乙酸处理lh,将凝胶片贴附在厚滤纸上，使用凝胶真空干燥器进行真空干燥，将凝胶片和x光底片贴紧，置于x光射线暗匣内，放超低温冰箱一7CTC使曝光rZwr,将x光底片显影，定影，冲洗得到PBPs的
7、放射自显影图谱。x光底片预曝光条件：(1)国产x光底片用照相闪光灯红色滤光片，加6层红色玻璃纸滤过，x光底片上覆盖6层红色玻璃纸，距离50cm,闪光灯闪二次；(2)进口x光底片预曝光用x光机最小功率100mA40kV,距离40em,每张x光底片曝光0.04so论文代写1.2.4竟争性结合试验定量菌液中分别加入不同浓度的甲氧西林保温37°C10min,然后加入饱和量的氛标记青霉素，37°C保温lOmin,再按上述方法继续进行实验。论文代写2结果与讨论论文代写本法测定肺炎链球菌全细胞中pBps的含量，首先需要分离菌体蛋
