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1、浅议青霉素结合蛋白测定技术【论文关键词】氘标记青霉素结合蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳荧光放射自显影【论文摘要】当前，细菌耐药性问题日趋严重，给临床治疗带来困难，对3-内酰胺类抗生素而言，某些菌青霉素结合蛋白（PBPs）改变造成的耐药性，是P-内酰胺类抗生素的特点。一般细菌的PBPs当前，细菌耐药性问题日趋严重，给临床治疗带来困难，对卜内酞胺类抗生素而言，某些菌青霉素结合蛋白（PBps）改变造成的耐药性，是卜内酞胺类抗生素的特点。一般细菌的PBPs均为胞浆膜上的蛋白质，是细菌致死的靶位。它的目、位置、亲和力的变化造成与卜内酞胺类抗生素不易结合而产生耐药性。人们
2、常采用SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳和放射自显影的方法研宄PBP谱，以便了解敏感菌和耐药-H-*的区别。所以，PBPs测定技术是研究压内酸胺类耐药性的重要手段［1］。的穿透力弱，用一般放射自显影法不能获得PBPs图谱，需采用荧光闪烁剂增效的“荧光放射自显影法”国内有关PBps测定技术报道甚少，以3H标记者更少，本文介绍这一技术。1材料与方法材料菌种肺炎链球菌31⑻3,30301（北京药品生物制品检定所;本室保存菌种。培养基C+Y培养基，参见文献（2）。仅器及药品垂直板凝胶电泳槽（吴县科研仪器厂）；NG—1型真空凝胶干燥器（太仓电视机厂）；TGLL—la型台式
3、高速冷冻离心机（中科院上海生物化学研究所）；8438—超低温冰箱（FormaSclentifi。，美国）；电泳仪DY—1型（上海医用分析仪器厂）；丙烯酞胺（Aerylamide，临海止学厂产）；甲撑双丙烯酞胺.（big;瑞士产品）；N，N，N，N一四甲基乙二胺（TEMED,上海前进农场制剂厂）；3H标记青霉素乙酞呱陡盐（NewEngiandNuclear,美国）；x光底片（天津感光材料厂;KodakDiangnostiefilmX—OmatARl3X18em）:2,5一二苯基嗯哇（PP0,闪烁纯，上海试剂一厂）；月桂酞肌氨酸钠（Sarkosyl,Sig
4、ma）:十二院基硫酸钠（SDs,上海新华化工厂）;二甲基亚矶（DMso,北京旭东化工厂）。方法肺炎链球菌PBPs样品的制备将肺炎链球菌按种c+Y培养基37°C过夜培养，次日再移种新鲜培养基中，37°C培养23h至对数生长期，菌数约为个/ml（CFU/m1），菌液分装试管，每管1ml于冰浴中加入不同浓度的氖标记青霉素37°C保温10min,在冰浴中加入5非标记青霉素G钠盐20万单位/ml，冷冻离心5000:/minlom仇，弃去上清，菌体沉淀用50以磷酸缓冲液0做成菌悬液，然后加入5—10拼一20%sarkosyl,37°C保温1Omin使细胞溶解，加入
5、30协一样品缓冲液，煮沸3min,置室温备用。聚丙烯鱿胺凝胶电泳采用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDSPAGE)方法。制备凝胶薄片(厚)，凝胶配方:分离胶(10%):Aerylamide:bis(30:),Tris(,/l)5ml,10%SDS,蒸馏水，真空搅拌10—15min除去气体，再加入TEMED,浓缩胶(5%):按上述配方依次为，，而，，，和150。先配制分离胶，灌注直立式电泳槽后，使凝胶凝固。次曰加入浓缩凝胶，放入加样梳，静置2h。在加样槽内依次分别加入PBps样品。接通电流，第一小时维持电压在60v，至染料前沿到达分离胶和浓缩胶交界
6、处调高电压至120v，走完全程约需3—4h，用考马斯蓝R250染色30—45min,过夜脱色。关光放射自显影方法凝胶片用二甲基亚矶(DMSo)处理30min,再用新鲜DMSo再次处理30而n，20%即。处理2—3h，l%甘油和1%乙酸处理lh，将凝胶片贴附在厚滤纸上，使用凝胶真空干燥器进行真空干燥，将凝胶片和x光底片贴紧，置于x光射线暗匣内，放超低温冰箱一70°C使曝光lZwr，将X光底片显影，定影，冲洗得到TOPS的放射自显影图谱。X光底片预曝光条件：(1)国产X光底片用照相闪光灯红色滤光片，加6层红色玻璃纸滤过，X光底片上覆盖6层红色玻璃纸，距离5
7、0cm，闪光灯闪二次；(2)进口x光底片预曝光用x光机最小功率100mA4OkV,距离40em,每张x光底片曝光。竟争性结合试验定量菌液中分别加入不同浓度的甲氧西林保温37°C10min，然后加入饱和量的氛标记青霉素，37°C保温10min,再按上述方法继续进行实验。2结果与讨论本法测定肺炎链球菌全细胞中pBps的含量，首先需要分离菌体蛋白，为使菌体蛋白浓度维持在一定的水平上，必须控制菌龄和菌液浓度。菌液浓度约CFU/mlo肺炎链球菌破碎细胞的方法以采用离子型去污剂sarkosyl为宜，它能选择性地作用于胞浆膜(3)，使胞浆膜破裂，菌体蛋白释放出来，与
8、此同时，已经与青霉素结合的膜蛋白PBPs也一起释放出来。样品制备完毕，煮沸3min,以便除去某
