青霉素结合蛋白测定技术的研究论文

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1、青霉素结合蛋白测定技术的研究论文钱海伦查永喜余江河阎晓菊李广银【论文关键词】氘标记青霉素结合蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳荧光放射自显影【论文摘要】当前,细菌耐药性问题日趋严重,给临床治疗带来困难,对β-内酰胺类抗生素而言,某些菌青霉素结合蛋白(PBPs)改变造成的耐药性,是β-内酰胺类抗生素的特点。一般细菌的PBPs当前，细菌耐药性问题日趋严重，给临床治疗带来困难，对卜内酞胺类抗生素而言，某些菌青霉素结合蛋白(PBps)改变造成的耐药性，是卜内酞胺类抗生素的特点。一般细菌的PBPs均为胞浆膜上的蛋白质，是细菌致死

2、的靶位。它的数目、位置、亲和力的变化造成与卜内酞胺类抗生素不易结合而产生耐药性。人们常采用SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳和放射自显影的方法研究PBPs图谱，以便了解敏感菌和耐药菌的区别。所以.freelaSclentifi。，美国);电泳仪DY一1型(上海医用分析仪器厂);丙烯酞胺(Aerylamide，临海止学厂产);甲撑双丙烯酞胺.(big;瑞士产品);N，N，N，N一四甲基乙二胺(TEMED，上海前进农场制剂厂);3H标记青霉素乙酞呱陡盐(NeX一OmatAR13X18em);2，5一二苯基嗯哇(PPO，闪

3、烁纯，上海试剂一厂);月桂酞肌氨酸钠(Sarkosyl，Sigma);十二烷基硫酸钠(SDs，上海新华化工厂);二甲基亚矾(DMso，北京旭东化工厂)。1.2方法1.2.1肺炎链球菌PBPs样品的制备将肺炎链球菌按种c+Y培养基37℃过夜培养，次日再移种新鲜培养基中，37℃培养2~3h至对数生长期，菌数约为个/ml(CFU/ml)，菌液分装试管，每管lml于冰浴中加入不同浓度的氖标记青霉素37℃保温10min，在冰浴中加入5非标记青霉素G钠盐20万单位/ml，冷冻离心5000:/minlom仇，弃去上清，菌

4、体沉淀用50以磷酸缓冲液(PH6.8)做成菌悬液，然后加入5一10拼一20%sarkosyl，37℃保温10min使细胞溶解，加入30协一样品缓冲液，煮沸3min，置室温备用。1.2.2聚丙烯鱿胺凝胶电泳采用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDSPAGE)方法。制备凝胶薄片(厚0.2cm)，凝胶配方:分离胶(10%):Aerylamide:bis(30:0.5)6.7ml，Tris(pH8.8，1.5ml/l)5ml，10%SDS0.2ml，蒸馏水8.1ml，真空搅拌10一15min除去气体，再加入TE

5、MED,浓缩胶(5%):按上述配方依次为1.7ml，2.5ml，0.1而，5.6ml，7.5，和150。先配制分离胶，灌注直立式电泳槽后，使凝胶凝固。次日加入浓缩凝胶，放入加样梳，静置2h。在加样槽内依次分别加入PBps样品。接通电流，第一小时维持电压在60v，至染料前沿到达分离胶和浓缩胶交界处调高电压至120v，走完全程约需3一4h，用考马斯蓝R250染色30一45min，过夜脱色。1.2.3关光放射自显影方法凝胶片用二甲基亚矾(DMSo)处理30min，再用新鲜DMSo再次处理30而n，20%即。处理2

6、一3h，l%甘油和1%乙酸处理lh，将凝胶片贴附在厚滤纸上，使用凝胶真空干燥器进行真空干燥，将凝胶片和x光底片贴紧，置于x光射线暗匣内，放超低温冰箱一70℃使曝光1~Z，闪光灯闪二次;(2)进口x光底片预曝光用x光机最小功率100mA40kV，距离40em，每张x光底片曝光0.04s。1.2.4竟争性结合试验定量菌液中分别加入不同浓度的甲氧西林保温37℃10min，然后加入饱和量的氛标记青霉素，37℃保温10min，再按上述方法继续进行实验。2结果与讨论本法测定肺炎链球菌全细胞中pBps的含量，首先需要分离

7、菌体蛋白，为使菌体蛋白浓度维持在一定的水平上，必须控制菌龄和菌液浓度。菌液浓度约CFU/ml。肺炎链球菌破碎细胞的方法以采用离子型去污剂sarkosyl为宜，它能选择性地作用于胞浆膜(3)，使胞浆膜破裂，菌体蛋白释放出来，与此同时，已经与青霉素结合的膜蛋白PBPs也一起释放出来。样品制备完毕，煮沸3min，以便除去某些蛋白质的干扰，青霉素与PBPs结合较牢固，不会被破坏。本实验采用SDS一PAGE方法(4-5)，SDS在分离胶与浓缩胶中的终浓度均为0.1%。分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为5%。氖标记物穿透

8、力较弱，用一般放射自显影方法不能得出图象，本实验采用荧光放射自显影法(6-8)(Fluoro，aphy)，检测聚丙烯酞胺凝胶片上3H标记的蛋白质，有一定的优点。PPO是荧光增效剂，其作用原理不是直接依赖sH放射出来的日射线，而是藉助3H上的日粒子与PPO相互作用发射出的光，造成x光底片的局部发黑得到深浅不同的暗线，从而获得青霉素结合蛋白的图谱。肺炎链球菌的PBPs图谱上可见有三条区带，即p即;(a，b)，pBpZ