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1、浅谈英丹通脉片对急性缺血/再灌注大鼠心肌一氧化氮合酶系统的影响【摘要】目的观察罠丹通脉片对缺血/再灌注大鼠心肌一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase,NOS)的影响。方法将雄性SD大鼠随机分为假手术组、缺血/再灌注模型组、罠丹通脉片+缺血/再灌注I组、罠丹通脉片+缺血/再灌注II组。大鼠麻醉开胸，结扎冠状动脉前降支40mim,再灌注4h。TUNEL法测定大鼠心肌组织的细胞凋亡，化学比色法检测心肌组织中总的一氧化氮合酶(NOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性，并计算出结构型一氧化氮合酶(cNOS)的活性。结果不同剂量的罠丹通脉片预处
2、理抑制缺血/再灌注大鼠心肌细胞凋亡，其凋亡指数与模型组比较均存在显著差异(P<0.05,P<0.01)o与假手术组比较，模型组心肌组织iNOS的活性增加(P〈0.05),cNOS活性降低(P<0.01)。不同剂量的罠丹通脉片能够抑制心肌缺血/再灌注大鼠iNOS的活性(P<0.05),增加cNOS活性(P<0.05,P<0.01)。结^罠丹通脉片能够抑制缺血/再灌注大鼠心肌细胞凋亡可能与调节心肌组织中NOS的活性有关。【关键词】罠丹通脉片;缺血/再灌注损伤;心肌;一氧化氮合酶;大鼠缺血性心脏病本质的病理改变是缺血心肌细胞因缺氧而坏死或凋亡，尽早恢复血液
3、灌流是治疗缺血性心脏病的首要措施。然而，再灌注损伤成为患者从缺血后复流获益的最大障碍。再灌注过程中，内源性一氧化氮(NO)所具有的双重性生物效应与NO的来源、释放的量以及靶组织的状态等多种调控环节相关。心肌中的一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase,NOS)是NO的限速酶,其同功酶的活性影响着NO的生物效应。罠丹通脉片能够减少急性心肌梗死面积，促进心脏功能恢复［1］,并改变犬心肌和血清中NO的水平［2］。本观察其对急性缺血/再灌注心肌细胞凋亡和再灌注心肌NOS的影响。1实验材料1.1动物健康成年SD雄性大鼠30只，体重250〜270g,
4、第四军医大学动物中心提供，合格证号：200505。1.2药物和主要试剂罠丹通脉片提取浸膏干粉(黄罠30g,丹参30g,当归15g,红花30g,桂枝10g,2.862g原药材/g干粉)由中国人民解放军第四军医大学科研药厂提供，以生理盐水配制成混悬液324g/LoTUNEL试剂盒为Roche公司产品,NOS和诱导型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)测定试剂盒购自南京建成生物工程公司,BCA蛋白定量试剂盒购自Pierce公司。2实验方法1.1分组及给药将大鼠随机分为4组：假手术组（A组）、缺血/再灌注模型组（
5、B组）、罠丹通脉片+缺血/再灌注I组（C组）、罠丹通脉片+缺血/再灌注II组（D组）°A、B组给予生理盐水［10mL/（kg・d）］灌胃，C、D组分别给予罠丹通脉片浸膏混悬液1.08g/kg和3.24g/kg灌胃［10mL/（kg・d）］,均连续灌胃6d0第7日，灌胃完成30min后进行造模。2.2心肌缺血/再灌注大鼠模型的制备参考文献［3］方法。雄性SD大鼠腹腔注射戊巴比妥钠30g/L（45mg/kg）麻醉。经颈部正中切口，插入气管套管，行呼气末正压通气（空气通气量20mL/kg,频率48〜50次/min）。经右颈动脉插入左心导管以测心功能参数。标
6、准导联II记录心电图（RM6200多导生理记录仪，成都仪器设备厂）o在胸骨左侧约0.5cm处从第4肋纵行切口开胸，剪开心包，暴露心脏，以左冠状动脉主干为标志，在左心耳根部下方2mm处用无创小圆针穿过左冠状动脉左降支根部下方的心肌表层，穿5-0线,将缝合线穿过小硅胶管后备用；待心电图恢复稳定，10min后记录正常参数。在硅胶管远端的收紧缝合线至硅胶管，形成弓状并固定，以阻断左前降支阻断血流造成缺血，以心电图ST段和(或)T波抬高或降低等心肌缺血波形为结扎成功指标，缺血40min,松解并除去硅胶管和多余缝合线，恢复左冠状动脉前降支，实现再灌注，逐层缝合胸
7、壁,恢复自主呼吸。A组动物开胸，冠状动脉下穿线，但不结扎。2.3TUNEL法测定心肌细胞凋亡再灌注结束后迅速剪下心脏，置于冰的PBS中洗净残血;分离左心室前壁缺血边缘区，于4%多聚甲醛中固定12h,石蜡包埋。检测前对石蜡切片进行微波修复，标记前用DNA酶处理切片做阳性对照。在染色过程中用PBS代替TdT反应液，其余同说明书操作，作为阴性对照。2.4心肌组织中一氧化氮合酶活性的测定实验完毕，摘除部分结扎线以下，置于冰的生理盐水中冲洗，除去血液，滤纸拭干，立即入液氮12h后，转至-70°C存放。分析天平称取0.1g左心室心肌组织，用生理盐水制备成10%的
8、组织匀浆，倒入离心管中，3000r/min离心10min,取上清液，用NOS测定试剂盒(化学比色法)测定大鼠
