病毒学检验实验指导

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1、病毒学检验实验指导病毒学实验考试备考指导编者：程家国（大理大学）指导教师：吴利先鸡胚接种原理鸡胚为活的动物机体，组织分化程度低，病毒易于增殖，可选择不同的日龄和接种途径，感染病毒的组织和液体中含大量病毒。鸡胚的结构与功能：鸡胚由三个胚层发育而来，即外胚层，屮胚层、内胚层，它们构成了胚胎的组织与器官卵壳:上有细孔，进行气体交换壳膜:使气体分子和液体分子在内外两方面进行交换。气室：绒毛尿囊膜:起胚胎呼吸器官的功能，氧气的交换是在膜的血管内通过卵売孔而进行的。尿囊腔:，内含有尿囊液，初为透明液体，是单纯生理盐溶液，以后尿囊液中尿酸盐迅速增加，胚胎发育到第12-13天后，尿囊液开始变得混浊。

2、羊膜与羊膜腔:其中盛有，胎体浸泡于其中卵黄:在胚胎发育早期供给鸡胚营养卵白:在胚胎发育受精卵的选择:最好是来自受精卵的壳最好是白色的受精卵必须新鲜，保存在5-20°C不要超过10天，保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。孵育:孵卵箱内的温度应保持在相对湿度：50%-60%必须保证有充分的新鲜空气流通，特别是在孵化5-6天以后从孵育后第3天开始，每天翻卵一次。检卵:自孵育后的第4天开始检卵，每天一次。孵育4・5FI于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。未受精卵：只见模糊的卵黄阴影，不见血管和鸡胚痕迹活胚：具有清晰的血管和鸡胚暗影，较大鸡胚还可见到胚动，但孵育14、15天以后胚动不明显，甚

3、至无胚动。死胚：血管昏暗模糊，没有胚动。接种前处理:用，用铅笔画岀并在将要接种的部位做好记号。对鸡胚进行消毒。鸡胚用于病毒培养的优缺点（一）优点:组织分化程度低，病毒易于增殖；可选择不同的日龄和接种途径；感染病毒的组织和液体中含大量病毒；容易采集和处理；来源充足；设备和操作简便易行（二）缺点:胚内可能污染细菌和病毒；母源抗体；许多病毒在鸡胚中增殖缺乏特异性的感染指针。接种方法途径：1）虫媒披膜病毒以及鹦鹉热衣原体和立克次氏体等的分离和增殖。2)：主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖3：该途径主耍用于临床材料(如患者的鼻洗液及咽漱液)的病毒分离。4：主要用于止粘病毒和副粘病毒，如流感病

4、毒、新城疫病毒的分离和增殖收毒：收毒前将鸡胚直立放置于4°C冰箱半小时以上，冻死胚胎，防止出血。根据接种途径的不同，收获相应的材料1、绒毛尿囊膜接种收获接种部位绒毛尿囊膜2、尿囊腔接种收获尿囊液3、卵黄囊接种收获卵黄囊或胚体4、羊膜腔接种收获羊水(0.5-lml)血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验实验原理：血凝试验(HA)原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物地红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝(HA)，也称直接血凝反应。①用以测定病毒的含量②计算病壽的血凝价，为血凝抑制试验做准备一个血凝单位：以50%的红细胞发生凝集的病毒悬液的最高稀释度作为该病毒液的红细胞凝聚

5、效价。血凝抑制试验(HI)原理：当病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI）反应，也称血凝抑制反应。①用于检测血清屮抗体含量②鉴定病毒的型、亚型；以出现++（50%凝集）的抗原最高稀释倍数为该抗原的血凝价以出现完全抑制凝集（即不凝集）的血清最高稀释倍数为该血清的血凝抑制价微牛物基因组DNA的提取?DNA提取的几种方法>非基因组DNA的提取：?1）质粒DNA的提取：碱裂解法、煮沸法?2）线粒体、叶绿体DNA的提取：差速离心结合SDS裂解法?根据

6、细胞裂解方式的不同有：物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法化学方式：异硫氧酸弧法、碱裂解法生物方式：酶法质粒DNA—碱裂解法：碱裂解法原理：染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到屮性pH吋即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。DNA提取的基本步骤：I•材料准备II•破碎细胞或包膜一内容物释放山•核酸分离、纯化IV•沉淀或吸附核酸，

7、并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸制备的一般原则：•分离纯化核酸总的原则：%1应保证核酸一级结构的完整性；%1排除其它分了的污染（蛋白质、脂类、糖、有机溶剂、金属离子、外源DNA、RNA等）。•核酸纯化应达到的要求：%1核酸样品中不应存在对酶冇抑制作用的冇机溶剂和过高浓度的金属离子；%1其它生物大分子的污染应降低到最低程度；%1排除其它核酸分子的污染。核酸制备时应注意的事项:：%1尽量简化操作步骤，缩短提取过程。%1减少化学因素对核酸的降解（如过