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1、第四节病毒的检验good常用的病毒检验方法包括：一、病毒的分离鉴定二、病毒感染性的检测三、病毒颗粒检测四、病毒的血清学检查五、病毒的分子(蛋白和核酸)检测一、病毒的分离鉴定病毒的分离与鉴定可为病毒感染提供最为直接的病原学证据，同时可为进一步的病毒学研究提供材料。病毒的分离和鉴定（含义）：指从病人、带毒者、外界环境中采集标本经过适当的处理,采用一系列物理、化学、生物学等手段,将病毒从标本中分离出来,并通过有关特异性方法鉴定属于何种病毒,这一方法称为病毒的分离与鉴定。病毒的分离与鉴定包括：1、病毒材料的采集与准备→2、病毒的分离与培养→3、病毒的形态学观
2、察→4、病毒的理化特性测定→5、病毒的血清学鉴定及病毒的分子生物学鉴定等基本过程。（一）标本的采取与送检病料采集适当与否,直接影响病毒的检测结果。一般可采集发病或死亡动物的组织病料、分泌物或粪便等,主要因动物及病毒的种类而异,例如检测犬细小病毒或轮状病毒,一般应采腹泻幼犬或犊牛的粪便;怀疑为口蹄疫的猪或牛,则应采其水疱液及水疱皮送检。应注意下列原则：1.对本身带有杂菌(如咽喉拭子、粪便)或易受污染的标本，要进行病毒分离培养时，应使用抗生素。2.因病毒在室温中易失去活性，标本应低温保存并尽快送检。3.血清学诊断标本的采取应在发病初期和病后2～3w内各取
3、1份血清，以便对比双份血清抗体效价的动态变化。标本处理：采集样本在接种细胞、鸡胚或动物之前,都需要做适当的处理,以保证病毒分离的成功几率。采集的器官或组织样本：如肺脏、脑、肝、脾、淋巴结等,可取一小块进行充分研磨,加入含青、链霉素的Hanks液,离心取上清液作为接种物;鼻液、脓汁、乳汁等分泌物或渗出液、粪便,应加入高浓度的抗生素,充分混匀后,置4℃冰箱内处理2~4h或过夜,离心后取上清做接种用;咽喉拭子在取样后应迅速将其浸泡入含有2%小牛血清和一定浓度的青、链霉素的Hanks液中,充分刷洗棉拭子,反复冻融3~5次,离心后取上清液作为接种材料。（二）病
4、毒的分离与培养细胞培养、鸡胚和实验动物可用于病毒的分离与培养,其中细胞培养是用于病毒分离与培养最常用的方法。用于病毒分离与培养的细胞有原代细胞、二倍体细胞株和传代细胞系,一般说来,本动物的原代细胞最为敏感,但不如传代细胞方便易得.例如猪传染性胃肠炎病毒初次分离最好用猪甲状腺原代或二倍体细胞,但该细胞生长缓慢,通常用PD5(猪甲状腺细胞系)取代。培养方法常用的有静置培养和旋转培养,有的病毒如轮状病毒,初次分离时旋转培养的成功率较静置培养高。1、病毒的分离不同的病毒分离时采用不同的分离方法,这主要取决于目的病毒的生物学特性。主要有细胞培养法、鸡胚接种法、
5、动物接种法等,而对细胞、鸡胚不敏感,又没有合适动物模型的病毒,可采用基因克隆的方法。（1）动物接种法是最原始的病毒培养方法，根据病毒种类不同，选择敏感动物及适宜接种部位，如嗜神经性病毒（狂犬病毒）可接种于小鼠脑内，痘病毒可接种于家兔角膜或皮内。动物的接种途径要根据病毒种类、实验动物种类、接种材料等选择合适的接种途径。动物接种途径的选择正确与否对提高病毒分离成功率也起到重要作用。常见病毒常用实验动物及接种途径P37在动物实验的期间或结束时采集动物血液检测病毒或特异性抗体。实验动物采血分为致死性采血和非致死性采血两种。致死性采血是指尽量采集动物血,直至动
6、物死亡。非致死性采血是指采集一定量的动物血而不致动物死亡。对采血动物,应在禁食24h后采血。采血应无菌操作。不同动物采用不同的采血方法。常用的有心脏采血法、眼眶采血法、颈静脉采血法、颈动脉采血法、耳静脉采血法等。根据实验动物和实验条件灵活选用。实验动物采血鸡胚对多种病毒敏感。不同病毒在鸡胚的不同部位的生长特性差异很大,因此选择适当的接种途径是病毒分离成功的关键。一般采用孵化9～14天的鸡胚，根据病毒种类不同，将病毒标本接种于鸡胚的不同部位，最常用的鸡胚接种部位有：尿囊腔、绒毛尿囊膜、卵黄囊和羊膜腔等。（2）鸡胚培养法是将离体活组织块或分散的组织细胞加
7、以培养的技术总称，为病毒分离鉴定中的最常用的基本方法。（3）细胞培养(cellculture)法或组织培养法(tissueculture)一般选择生长旺盛的敏感细胞用于病毒分离。少数病毒例外,例如犬、猪等的细小病毒,病毒的复制有赖于分裂旺盛的细胞,因此需将病毒接种与细胞培养同步进行。细胞培养技术在病毒发现、病毒研究、疫苗研制、抗病毒药物筛选等病毒学发展的历程中发挥着重要作用。常见人类病毒的敏感细胞P36P36（4）分子生物学技术对体外培养的细胞、鸡胚、动物不敏感的病毒,可采用现代分子生物学技术,如基因克隆技术,对病毒的全基因进行克隆,构建表达载体,并
8、能表达出病毒样颗粒。（三）病毒的鉴定步骤：1、初步鉴定2、接种动物的观察3、最终鉴定1、初步鉴定(1)根据临
