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1、病毒学实验技术实验一鸡胚接种器材：鸡胚打孔器注射器针头照蛋灯蛋座病毒液石蜡碘酊棉球酒精棉球鸡胚孵化f病毒接种（NDV、EDS—76、IBV-＞效价测定（HA、H1）一.精卵的选择、孵育和检卵1.受精卵的选择1）最好来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响2）最好是白克蛋3）受精卵必须新鲜，保存在5-20°C不要超过10天，保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。2.孵育1）孵箱温度保持37.5—38.5°C2）相对湿度:50-60%3）保证新鲜空气流通，尤孵化5-6天后4）孵育后第三天开始，每天翻卵一次3.检卵
2、孵育后第4天开始，每天检卵一次。4日卵可见血管。未受精卵不见血管鸡胚。死胚血管模糊，无胎动。二.鸡胚的结构1.卵壳上有细孔，以行气体交换2.壳膜行气体和液体分子交换，故须一定湿度和气流3.气室呼吸和调节压力4.绒毛尿囊腔胚胎呼吸器官，膜血管一02—卵売孔交换5.尿囊腔胚胎排泄器官，冰囊液初为通明，12-13天后因球酸盐增多而渐浑浊。6.羊膜腔胚胎浸泡于其屮羊水7.卵黄早期养分8.卵白晚期养分三.接种前处理1•做接种记号2.消毒四.接种途径卵黄囊、球囊腔、绒毛球囊膜、羊膜腔、静脉、胚体1.卵黄囊接种法虫媒
3、披膜病毒、衣原体、立克氏体等分离和增殖方法一：1）6-8H龄胚，画岀气室和胚位，大头朝下方法二2）碘及酒精消毒气室端3）钢锥在气室屮央锥一小孔4）注射器吸取病毒液，沿小孔垂直刺入3cm,0.1-0.3ml/胚5）熔蜡封孔，续孵，弃24H内死胚1）2）同一3）卵横放，胚朝下，卵长1/2处消毒4）钢锥锥一小孔,注射器吸取病毒液,沿小孔垂直刺入1.5CM,0.1-0.5ml/胚5）封孔，续孵，弃24h内死胚2.绒毛尿囊膜接种法痘病毒和疱殄病毒分离和増殖方法一：1）10-12n龄胚，画气室，消毒2）在气室端开一
4、1.5X1.5口3）灭菌银子撕去一小片内壳膜4）滴入接种物5）胶布或透明纸封口方法二：（人工气室）1）在胚胎附近近气室处，选血管少处，烙一直径3-4mm的烤焦圈］2）消毒，刀撬起卵壳造成卵窗3）在气室端中央钻一个小孔4）用针尖挑破卵窗中心的壳膜，勿损伤其下的绒毛尿囊膜，滴加生理盐水于刺破出5）橡皮乳头于小孔上吸气，形成人丄气室，可见绒毛丿永囊膜上滴加的生理盐水卜•渗6）用lmlL注射器滴2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上7）胶布或透明纸封口，熔蜡封孔8）鸡胚横卧孵育，勿翻动，卵窗向上2.尿囊腔接种法用于止粘病
5、毒，副粘病莓分离和增殖1）选10-12日龄胚，画气室胚位，消毒2）钢锥锥一小孔3）注射器吸取病毒液，沿小孔刺入0.5-lcm,0.1-0.2/胚4）熔蜡封孔，续孵，检卵1次/天，弃24h内死胚静脉接种：蓝舌病毒；脑内接种：狂犬病毒实验二原代细胞培养（鸡胚成纤维细胞）器材：鸡胚碘酊棉球，酒精棉球照蛋灯蛋座大剪子眼科剪银子平皿培养基胰酶水浴锅大青霉素瓶吸管吸球细胞瓶瓶塞一.实验目的：了解原代细胞培养的一般方法和用途二.实验步骤：1.取9-12H龄鸡胚，依次用碘酊和酒精消毒2.无菌夹起鸡胚置于无菌平皿3・眼科
6、剪银去头、四肢及内脏，Hank'S洗液两次3.剪碎近于乳糜状4.将剪碎组织倒入锥形瓶或烧杯或大青霉素瓶，Ilank，S两次，然后加入4倍量的（5ml）0.25%胰酶，调PH值7.6-7.8（NaHCO35.6%^7.5%、8.8%）,混匀后置37°C水浴20-30分钟,期间每lOmin摇动一次，使细胞消化完全（组织块变松散，沉降变缓慢时表示消化足够）5.消化好后，取出瓶子，静置几分钟，洗去胰晦液，加含有犊牛血清的Hank，S液生长液约10ml,轻摇后吸去，重复一次，冃的洗去残留的胰酶和抑制其消化作用6.
7、加入生长液10ml,以粗口吸管吹吸数次，使细胞脱落分散，静置1-2分钟，使组织块下降，轻吸出细胞悬液于离心管屮&平衡后以2000r/minl0min,弃上清，用10mlHank'S液生长悬浮沉淀，分装于两个细胞瓶屮，2ML/瓶。使细胞量约为50万个/ml,再补加Hank,S生长液至10mb37°C培养实验三传代细胞培养（传代细胞二遗传突变/理化学物质作用/致瘤病毒作用二异倍体癌变细胞；多来门动物或人的肿瘤组织及部分来白突变的正常细胞。成长旺盛，繁殖快速，但易遭支原体和病毒污染—细胞源性/非-细胞源性如毒
8、种、血清、胰酶、操作人员口鼻手等）一、试剂1.细胞分散剂：0.25%胰酶，250ML装，4°C保存胰酶2.5gNaCl8.0gKCL0.2gNa2HPO4•12H.02.89gKH.POi0.2g加ddH20至1000ml加压过滤除菌,分装于小瓶备用。（细胞消化液:将胰酶2・5g、NaCl80.0g.KCL4.0g、葡萄糖10.0g、NaHCO35・8g依次溶于900.0mlddH20中,待完全溶解后,定容至1000.0ml,过滤除菌，分装
