叶绿素的提取与含量测定

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1、实验报告课程名称：植物生理学实验指导老师：成绩：__________________实验名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定实验类型：同组学生姓名：一、实验目的和要求（必填）二、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填）四、实验器材与仪器（必填）五、操作方法和实验步骤（必填）六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析（必填）八、讨论、心得一、实验目的和要求：1．掌握植物中叶绿体色素的提取分离和性质鉴定。2．掌握定量分析的原理和方法。装订二、实验内容和原理：以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。原理如下：1．叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而

2、溶于有机溶剂，常用95%的乙醇或80%的丙酮提取。线2．皂化反应。叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。3．取代反应。在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg2+,可依次被H+和Cu2+取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。4．叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。5．定量分析。叶绿素吸收红光和蓝紫光，红光区可用于定量分析，其中a,b及总量，而652可直接用于总量分析。645和663用于定量叶绿素三、实验材料与试剂材料：青菜叶试剂：KOH固体、醋酸铜粉末、醋酸四、主要仪器设备：1．天平（万分之一）、可扫描分光光度计、

3、离心机2．研具、PE管、酒精灯等五、操作方法和实验步骤（必填）1．定性分析：荧光现象：鲜叶3-5g+95%乙醇15ml（逐步加入）,磨成匀浆，过滤入三角瓶，观察荧光现象皂化反应：加KOH数片剧烈摇均，加石油醚1ml和H2O1ml，分层后观察取代反应：加醋酸约1ml，观察颜色，取1/2加醋酸铜粉，加热变亮绿色2．叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：皂化反应的上层黄色石油醚溶液（稀释470nmOD0.5-1），在400-700nm处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素的吸收峰反复用石油醚粹取,直到无类胡萝卜素,离心得叶绿素(盐)，（稀释663nmOD0.5-1），分别测定叶绿素的吸收峰3．叶绿素定量分析：鲜

4、叶0.1g，加1.9mlH2O，磨成匀浆，取清液在645，652，663测定OD，计算2份0.2mlChla,Chlb和加80%丙酮4.8ml,Chl总量的值。摇匀，4000转离心3min,上六、实验数据记录和处理1．荧光现象：透射光绿色，反射光红光2．皂化反应：上层呈黄色，为类胡萝卜素，吸收蓝紫光。下层呈绿色。为叶绿素。吸收蓝紫光和红光。皂化反应分层3.类胡萝卜素和叶绿素的吸收光谱测定：上层黄色溶液扫描光谱吸收峰为468nm、439nm、413nm、667nm和606nm五个下层绿色溶液扫描光谱吸收峰为414nm、526nm、639nm三个4．取代反应：加醋酸约1ml，变褐（取1/

5、2加醋酸铜粉加热变去镁叶绿素）亮绿色，为铜代叶绿素。去镁叶绿素铜代叶绿素5.叶绿素含量测定波长/nm吸光度（第一组）吸光度（第二组）6450.0680.0726520.0930.0956630.1640.170根据公式：Ca(mg/L)=12.7OD663-2.69OD645Cb(mg/L)=22.9OD645-4.68OD663C=OD1000/34.5T(mg/L)652Chla含量(mg/g.FW)=（Ca(mg/L)/1000）2/0.15/0.2Chlb含量(mg/g.FW)=（Cb(mg/L)/1000）2/0.15/0.2Chl总含量(mg/g.FW)=（C/1000）2/0.

6、15/0.2T(mg/L)求得：C=1.899mg/LCa2=1.965mg/La1Cb1=0.790mg/LCb2=0.853mg/LCT1=2.696mg/LCT2=2.754mg/LChla含量1=0.950mg/g.FWChla含量1=0.982mg/g.FWChlb含量1=0.395mg/g.FWChlb含量1=0.426mg/g.FWChl总含量1=1.348mg/g.FWChl总含量1=1.377mg/g.FW七、实验结果与分析类胡萝卜素和叶绿素的吸收光谱测定：类胡萝卜素的吸收峰为蓝紫光区468nm、439nm、413nm三个峰，在红光区667nm和606nm的峰说明叶绿素有残留

7、。叶绿素在蓝紫光区有414nm、526nm两个峰，在红光区有639nm一个峰，蓝紫光区的峰比红光区的高，说明叶绿素吸收蓝紫光的能力比红光强。叶绿素含量测定：Chla含量1=0.950mg/g.FWChla含量1=0.982mg/g.FWChlb含量1=0.395mg/g.FWChlb含量1=0.426mg/g.FWChl总含量1=1.348mg/g.FWChl总含量1=1.377mg/g.FW两组