实验二植物叶绿素含量测定----丙酮提取法

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1、二、桢物叶绿素含测记----W酮提取法高等植物光合作用过程中利用的光能是通过叶绿体色素（光合色素）吸收的。叶绿体色素山叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素飢成。叶绿体色素的提取、分离和测定是研究它们的特性以及在光合屮作用的第一•步。叶片叶绿索含:虽:与光合作用密切相关，是反映叶片生理状态的重要指标。在梢物光合生理、发育生理和抗性生理研究中经常需要测定叶绿素貪量。叶绿素量也是指导作物栽培生产和选育作物品种的重耍指标。［原理］叶绿索不溶于水，溶于冇机溶剂，吋用多种有机溶剂，如W酮、乙醇或二甲基亚砜等研磨提取或浸泡捉取。叶绿色素在特定提取溶液屮对特定波长的光有圾大吸收，用分光光度计测记在该波长下叶绿

2、素溶液的吸光度（也称为光密度），再根据叶绿素在该波长下的吸收系数即可计算叶绿素含量。利用分光光计测定叶绿素含量的依据是Lambert-Beer定律，即当一束单色光通过溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。其数学农达式为：A=Kbc式中：A为吸光度；K为吸光系数；b为溶液的厚度；c为溶液浓度。叶绿素a、b的丙酮溶液在可见光范围内的最大吸收峰分别位于663、645nm处。叶绿素a和b在663nm处的吸光系数（当溶液厚度为1cm，叶绿素浓度为时的吸光度）分别为82.04和9.27;在645nm处的吸光系数分别为16.75和45.60。根据Lambert-Beer定律，叶绿素溶液在6

3、63nm和645nm处的吸光度（A663和八撕）与溶液屮叶绿素a、b和总浓度（a+b）（Ca、Cb、Ca+b,单位为,的关系可分别川下列方程式表示：A663=82.04Ca+9.27Cb(1)A645=16.76Ca+45.60Cb(2)解万程(1)和(2)得：Ca=12.7A663-2.59(3)Cb=22.9A645—4.67A663(4)Catb=20.3Ag45—8.04Ag63(5)从公式（3）、（4）、（5）可以看出，只要测得叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度，就可计算出提取液中的叶绿素a、b浓度和叶绿素总浓度（a+b）0在652nm处，叶绿索a和b的吸光系数相同，因此提

4、取液屮叶绿素的总浓度（a+b）也可通过测定溶液在波长652nm处的吸光度（A652）求得，其计算公式为:A652x100034.5Ca十b=（6）式巾：34.5为叶绿素a和b在波长652nm处的吸光系数。但Inskeep等（1985）认为叶绿素a和b吸光系数相等时的波长位于吸收光谱斜率很陡的位S上，因此仪器波长很小的偏差都可能导致很大的测定误差。所测定材料的单位面积成单位巫量的叶绿素iVffl可按下式进行计算：CxVAx1000叶绿素含:虽（mg.g_1或mg.dnV2）=（7）式中：C为叶绿素浓度（mg-L；1）或mg-dm'2）；V为提取液总体税（ml）；A为取样鲜重（g）或取样面积（dm

5、"2）。［材料、仪器、药品］1.材料：植物绿色叶片。在本实验屮利用光合速率测定实验屮取回室内的绿色半叶和黄色半叶为试材。2.仪器：（1）分光光度计；（2）天平；（3）研钵；（4）滤纸；（5）漏斗；（6）5ml移液管；（7）打孔器；（8）滴管；（9）剪刀；（10）25ml容量瓶；（11）毛刷；（12）擦镜纸。［方法］1.取样：用毛笔或毛刷淸除叶片农面的灰尘，用打孔器从绿叶和黄叶上各打取0.25dnV2的叶W片，立即称重，剪碎C放入研钵中。（在正规实验中应各熏复3次，本实验为减少丙酮向环境中的排放，故不没重父）。注意取样时耍避开人的叶脉。如果需耍计算叶片干样叶绿素含量，另取一份相同样品S于烘箱中烘

6、干，用于测定干重。1.研磨提取:向研钵中加入80%丙酮2.5ml,以及少许CaCO3（屮和酸性，防止叶绿素酯酶分解叶绿素）和石英砂，研磨成匀浆，再加入3ml80%内‘酮，继续研磨至组织变白，在暗处静止3〜5min后，用一层干滤纸过滤到25ml容跫瓶屮，用滴筲吸取80%W酮将研钵洗浄，淸洗液也耍过滤到容足瓶中，并川80%闪酮沿滤纸的周围洗脱色素，待滤纸和残渣全部变LlU,川80%闪酮定'容2R刻度。2.读取吸光度：取厚度为Icm的洁净比色皿，注意不要用手接触比色皿的光而，先用少虽色素提取液淸洗2〜3次，注意淸洗时要使淸洗液接触比色IIIL内壁的所有部分，然后将色素提取液倒入比色皿屮，液面高度约为

7、比色皿高度的4/5,将撒在比色皿外而的溶液川滤纸吸掉（注意不能擦），W•川擦镜纸檫干擦净。将比色皿放入仪器的比色皿架上，注意不嬰将溶液撒入仪器内。第一个位H放盛奋80%丙酮的比色皿，做为空白对照。将仪器波长分别调至663、645、652nm处，以80%丙酮做为空门对照调透光率100%,分别测定溶液在上述三个波长下的吸光度。饵个样品重复测定3次。注意，每次在转换波长时，都要用80%丙酮调透光率100