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1、实验二鱼类肌肉蛋白的提取、蛋白含量测定及其SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳检测及其Westernblotting鉴定一、实验内容1.利用机械破碎和高速离心分离等手段，从不同种类的血肌肉屮提取水溶性蛋口和盐溶性蛋口。2.采用紫外吸收法测定以上各蛋白捉取液屮的总蛋白含量。3.对以上蛋口提取液进行SDS・聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测，并利用凝胶成像系统软件对电泳结果进行分析。4.将以上提取的水溶性蛋白和盐溶性蛋白进行Westernblotting鉴定。二、实验目的和要求1.了解从动物组织屮提取蛋白的原理和实验方法。2.熟悉蛋口
2、质含量测定的各种方法和基本原理，并根拯实验结果，比较不同种类的鱼肌肉屮水溶性蛋白和盐溶性蛋白含量的差异。3.掌握SDS-PAGE的原理和垂直板型凝胶电泳的操作方法，并根据电泳结果，比较不同种类的鱼肌肉中水溶性蛋白和盐溶性蛋白成分的差异。4.掌握Westernblotting操作方法。三、实验仪器、材料和试剂（-）仪器微量移液枪及枪头、微量离心管（乂称Eppendorf管）、50ml离心管、常用玻璃器皿（见表1）、台式天平、组织捣碎机、高速冷冻离心机、紫外分光光度计、垂直式电泳槽装置、凝胶成像系统。（二）试剂准备1・BufferI
3、（2000ml）：20mMTris-Cl,pH&0。2.BufferII（500ml）：BufferI含有0.5MNaCl。、实验操作（―）动物肌肉蛋白的提取1.称取新鲜的淡水鱼或海水鱼剔除鱼鳞、鱼刺及脂肪取肌肉，用刀切碎,称取3g左右，加入30ml左右冰冷的BuffferI（鱼肉[g]：BuffferI[ml]=l:10）,在捣碎机中捣碎成匀浆。2.将以上匀浆转入50ml离心管中，在4°C下，10000Xg,离心15min,将上清和沉淀分开。3•上清用四层纱布进行过滤除去脂肪，滤液即水溶性蛋口提取液（留样（1.5ml）＞量体积
4、、测蛋白含量、SDS化）4.在以上沉淀屮，加入30ml冰冷的BuffferI,重悬沉淀，在4°C下,10000Xg,离心15min,取沉淀。5.重复操作4一次。6.在以上沉淀中，加入30ml冰冷的BufferII,重悬沉淀，再次用组织捣碎机进行捣碎。7.将以上匀浆转入50ml离心管屮，在4°C下，lOOOOXg,离心15min,将上清和沉淀分开。上清即为瓜溶性溶性蛋山提取液（留样（15ml）.量体积、测蛋白含量、SDS化）（二）蛋白含量测定（紫外吸收法）取适量的样品提取液（以上水溶性蛋口液/盐溶性蛋白液），根据蛋口质浓度，用Bu
5、fferI适当稀释后，用紫外分光光度计分别在280nm和260nm波长下读取吸光度，以BufferI为空白调零。结果计算:蛋白质浓度=nX（1.45A280—0.74A260）（mg/mL）式中:1.45和0.74为校正值;A280为蛋白质溶液在280nm处的吸光滾；A260为蛋口质溶液在260nm处的吸光度；n为稀释倍数。（三）蛋白提取液的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析1.聚内烯酰胺凝胶的配制（1）分离胶（10%）的配制（10ml）：ddH2O4.0ml30%储备胶3.3ml1.5MTris-HCl(pH8.8)2.5ml10
6、%SDS0.1ml10%AP0」mlTEMED4u1混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平（凝胶完全聚合需30-60min）o（2）积层胶的配制（5ml）：ddH2O3.4ml30%储备胶0.83mllMTris-HCl(pH6.8)0.63ml10%SDS0.05ml10%AP0.05mlTEMED5uI将分离胶上的水倒去，加入上述混合液，立即将梳了插入玻璃板间（完全聚合需15-30mim）o2.样品处理：将样品（以上水溶性蛋白液/盐溶性蛋白液）加入等量的2xSDS上样缓冲液，100°C加热5min,离心12000gXlm
7、in,取上清作SDS-PAGE分析，同时将SDS分子量蛋白标准品作平行处理。3•上样：分别取10P1处理后的样甜加入样甜池中，并加入6口1蛋白标准品作对照。4.电泳：在电泳槽屮加入lx电泳缓冲液，连接电源，注意正负极接向。电泳时，刚开始电压控制在90V,当样品到达分离胶后，可将电压调至180V,电泳至混酚兰行至电泳槽下端停止。1.染色：将胶从玻璃板中小心取出，用考马斯亮兰染色液染色。2.脱色；将胶从染色液屮取出，放入脱色液屮，脱色至蛋白带清晰。7•凝胶摄像和保存：在图像处理系统下将脱色好的凝胶摄像，并利用系统软件分析实验结果，凝
8、胶可保存于双蒸水屮或7%乙酸溶液屮。（四）蛋白提取液的Westernblotting鉴定1.将以上捉取的水溶性蛋白和盐溶性蛋白利用12%SDS-PAGE电泳分离。2.用半干式电转移法将蛋白转至NC膜上。1）将聚丙稀酰胺凝胶浸泡在电转移缓冲液屮平衡lOmino2）
