大豆蛋白的提取及与含量测定

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1、大豆蛋白的提取及与含量测定在此处键入欢迎信息，长短均可。最好包括本站点的内容简介。一、目的要求1.学习掌握离心机、752N、天平的使用方法和注意事项；2.学习掌握大豆蛋白的提取及制备丙酮干粉的原理和方法；3.学习计算蛋白质收率,测定蛋白质含量二、实验原理（一）1.大豆蛋白的等电点为4.5-5.0是酸性蛋白，尽管大豆中含有水溶蛋白、盐溶蛋白、碱溶蛋白和醇溶蛋白，但其主要成分为碱溶蛋白，本实验为节省丙酮用量只进行碱提；2.丙酮（有机溶剂）可降低溶液的介电常数、破坏蛋白质的水化膜，故可使蛋白质在一定条件下沉淀析出；调节蛋白质溶液的pH值到等电点附近，有利于蛋白质的沉淀。三

2、、试剂、材料及仪器1.0.2%的NaOH；2.6mol/L的HCl；3.1mol/L的HCl4.化学纯级丙酮5.市售大豆粉6.精密pH试纸7.天平8.离心机（普通）9.离心内、外套管10.烧杯11.搅拌棒四、实验步骤提取：.称取3克大豆粉，用0.2%NaOH30毫升。（先加入调成糊状，再用少量多次地慢慢地加入（边加边搅拌）NaOH溶液），室温下搅拌抽提15min，于6000r/min离心7min,小心留取上清液，弃脂层和沉淀，如上清液有漂浮物，再经过滤；留出上清液2毫升稀释50、100倍做含量测定三、实验步骤制干粉：量上清液的体积，加入等体积在冰箱中预冷的丙酮，先用

3、6mol/L的HCl调pH至6.0，再用1mol/L的HCl小心调pH至4.5-5.0，于4000r/min离心15min，(留取沉淀物)，并用少量丙酮反复(至少两次)搅拌洗涤（在离心管中进行），加入丙酮后一定将沉淀搅拌充分，加入丙酮目的使沉淀脱水。得到白色粉末状的大豆蛋白粉（上清液回收），用干净的滤纸吸干、平铺在表面皿上，放入40度烘箱干燥，待整个实验结束后，再称重并计算产率。Folin酚法测定蛋白质含量目的要求掌握Folin酚法测定蛋白浓度的原理和方法实验原理蛋白质浓度可以从它们的物理化学性质，如比重、紫外吸收，折射率等测定而得知；或用化学方法，如定氮、双缩脲反

4、应，Folin酚试剂反应等方法来计算。其中双缩脲法和Folin酚法是一般实验室中常用的方法，它们操作简便，迅速，不需要复杂而昂贵的仪器。Folin酚法灵敏度高，比双缩脲法灵敏100倍。Folin酚法所用试剂是由两部分组成，试剂甲相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中的肽链起显色反应。试剂乙中的磷钼酸和磷钨酸在碱性条件下不稳定，易被酚类还原而呈兰色（钼兰和钨兰混合物）。由于蛋白质中含有带酚基的酪氨酸还原呈兰色，溶液兰色的深浅与蛋白浓度有较好的线性关系。因此用Folin酚法测定蛋白质含量，灵敏度较高。样品中含酚类化合物及柠檬酸均有干扰作用，如果样品酸度较高则显色较浅，要提高碳酸

5、钠一氢氧化钠的浓度。此法也可测定溶液中酪氨酸的色氨酸的浓度。Folin酚法有不少具有操作方法，但基本原理都是一个，只是在各溶液的浓度及填加量上，保温的温度及保温时间上有所不同而已，本实验所介绍的是本室常用的，灵敏度较高的操作方法。试剂和器材1、材料：本实验所提取大豆蛋白水提取液，经合适稀释至可测定范围。2、试剂：（1）0.03mol/LPH7.8的磷酸缓冲液。（2）200μg/ml的标准酪（牛血清）蛋白溶液。（3）Folin试剂甲：（俗称碱性铜试剂）：10gNaoH溶于400ml水中，再加50gNa2CO3；称取0.5g酒石酸钾钠溶于80mlH2O中，再加0.25g

6、CuSO4；以上两溶液混合定容到500ml，冰箱保存可用一个月。(4)、Folin试剂乙：在2升磨口回流装置的烧瓶内，加钨酸钠（NaWO4·2H2O）100g，钼酸钠（NaMoO·2M2O）25g，蒸馏水700ml，85%的磷酸50ml，浓盐酸100ml，充分混合后，小火回流10小时，再加硫酸锂（Li2SO4）150g，蒸馏水50ml及数滴溴。然后开口沸腾15min，以驱除过量的溴，冷却后定容到1000ml，过滤后呈金黄色，于棕色并中保存，可使用多年。上述制备的Folin试剂乙的贮备液浓度一般在2mol/L左右，几种操作方案都是把Folin试剂乙稀释至1mol/L的

7、酸度作为应用液，我们是把贮备液于作用前稀释18倍，使之浓度为0.1mol/L略高。这种稀释18倍后的Folin试剂乙就是下文称之为应用液，Folin试剂乙贮备液浓度的标定，一般是以酚酞为指示剂，用Folin试剂乙去滴定1mol/L左右的标准NaOH溶液，当溶液颜色由红变为紫灰色，再突然变成黑绿既为终点。如果用NaOH去滴定Folin乙，终点不太好掌握，溶液的颜色是由浅黄色变为浅绿色，再变为灰紫色为终点。3、器材：试管10支试管架一个移液管：（5ml、1ml）移液管架洗瓶恒温水浴752N型分光光度计操作方法标准曲线的制作：标准酪蛋白溶液：用0.03mol/L的磷酸