实验十病原菌的分离鉴定及其疫苗的制备一(22页)

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1、实验十病原菌的分离鉴定及其疫苗的制备-、实验目的熟悉水产细菌性病原的分离、培养、纯化与鉴定的基木方法，了解所分离细菌性病原的形态特征及培养特点，了解细菌性灭活疫苗制备的基木过程。二、实验材料患口内障病虎纹蛙（或我他患细菌性疾病的水产动物）、健康虎纹蛙、脑膜炎败血黄杆菌（虎纹蛙白内障病的病原）三、实验药品、用具2216E琼脂平板、2216E琼脂斜面、福尔马林、无菌蒸锚水、生理盐水、磷酸缓冲液、接种环、解剖刀、剪刀、铁子、滴管、纱布、白瓷盘、酒精棉球、灭菌试管、96孔板、注射器、酒精灯、离心机（包括离心管）、水族箱、

2、记号笔、四、实验操作程序（-）病原菌的分离与鉴定1・培养基的制备（1）普通肉汤培养基：按以下剂量称取各种试剂（先称取盐类再称蛋白腺及牛肉膏），置于铝锅或搪瓷缸中。牛肉膏5g磷酸氢二钾lg蛋白陈10g蒸懈水1000ml氯化钠5gpH7.4〜7.6初配好的培养基呈酸性故耍用NaOH调整。将pH测定后的肉汤培养基用滤纸过滤，将过滤好的肉汤分装试管、盐水瓶、三角烧瓶等容器，待火菌。（2）普通营养琼脂培养基普通肉汤1000ml琼脂20g琼脂是由海藻中提取得--种多糖类物质，对病原性细繭无营养作用，但在水中加温可融化，冷却后

3、可凝固。在液体培养基中加入琼脂1.5〜2%即可固定培养基，如加入0•3〜0.5%则成半固体培养基。将称好的琼脂加到普容肉汤中，加热煮沸，待琼脂完全融化后，将pH调至7.4〜7.6o琼脂融化过程中需不断搅拌，并控制火力，不使培养基溢出或烧焦，并注意补充蒸发掉的水份。加热溶解好的培养基对用滤纸进行过滤，固体培养基要用4层纱布趁热过滤（切勿使培养基凝固在纱布±），之后按实验要求，将配制好的培养基分装入试管或三角瓶中，包扎好待灭菌，将培养基置于高压蒸汽锅内，121°C灭菌15〜30min,趁热将试管口-•端搁在玻棒上，使

4、之有一定斜度，凝固后即成普通琼脂斜面，也可直立，凝固后即成高层琼脂。盐水瓶屮的普通琼脂以手学感触，若将瓶紧握手屮觉得烫手，但仍能握持者，此即为倾倒平川I•的合适温度（50〜60°C）,每只灭菌培养皿倒入约15〜20ml,将皿盖盖上，并将培养皿于桌面上轻轻回转，使培养基平铺于皿底，即成普通琼脂平板。培养基中的某种成分，如血淸、糖类、尿索、氨基酸等在高温下易于分解、变性，故应过滤除菌，再按规定的量加入培养基中。2.病原菌的分离与培养分离病原菌的材料要求是貝有典型患病症状的活的或刚死不久的患病生物，病原菌的分离方法如下

5、。体表分离：先将病灶部位表面用70%酒精酒精棉球擦拭消毒或取病灶部分小片或用经酒精灯灼烧的解剖刀烫烧消毒，再用接种环刮取病灶深部组织或直接挑収部分深部患病组织，接种于普通肉汤培养基增菌或亡接在普通琼脂平板上划线分离。内部组织器官：用70%酒精浸过的纱布覆盖体农或用酒精棉球擦拭，进行体农消毒，无菌打开病位的腹腔，以肝、肠、心脏等脏器为材料，先将拟分离病原的部位表面用70%酒楮棉球擦拭或用经火焰上灼烧后的解剖刀烫烧，以杀死表面的杂菌，随即在烧灼部位刺一小孔，用灭菌的接种环（待冷2〜5秒）伸向烧灼部小洞屮，用手指将接种

6、坏轻轻旋转两次，借以达到取足材料的H的。左手持握普通琼脂平板，并靠近火焰，右手持取材后的接种坏在琼脂平板上分区划线接种。划线时接种坏面与平板表面成30〜40度的角轻轻接触，在平板表而轻快地移动，接种环不应嵌入培养基内，且不耍重复，否则形成菌苔。划线完毕，盖上皿盖，接种环灭菌后放下，并在平皿底部用记号笔注明接种材料、口期及操作者代号。也可对实质性脏器用无菌剪刀下一小块，用锻了夹住病料使其剖而接触洁净的玻片，作多个触片，染色后在显微镜下胃接镜检，能快速获得结果。鲍部：用无菌接种环刮取鲍上的分泌物划平板。血液及体液：用

7、无菌注射器吸取病他血液和体液，滴于平板涂布；或用灭菌后的接种环挑収血液和体液后于平板上划线，分离细菌。接种后的平板经30°C左右培养24〜72h后，检查菌落生长情况，对菌落检査的主要内容包括：（1）大小:其大小以mm表示，微小菌落：针尖大，直径小于0.5mm,如支原体菌落、猪丹毒杆菌菌落；小菌落：直径在0.5〜1mmZ间，如嗜血杆菌、布氏杆菌菌落；屮等人小的菌落：直径在1〜3mmZ间，如巴氏杆菌、沙门氏杆菌菌落；大的菌落：直径大于3nmi,如炭疽芽抱杆菌菌落等。（2）形态：圆形，不规则形（根状、树叶状）（3）边缘

8、：整齐，不整齐（锯齿状、虫蚀状、卷发状）（4）表而：光滑、粘液状、粗糙、荷包资状、漩涡状、颗粒状（5）隆起度：隆起，轻度隆起，中央隆起，平升状、扁平状，脐状（凹陷状）（6）颜色：无色、灰白色、白色、金黄色、红色、粉红色（7）透明度：透明、半透明、不透明（8）溶血性：B—溶血（完全溶血），a一溶血（不完全溶血），不溶血根据菌落数暈和特征，挑选可能的病原菌菌落进一步划线纯化1