6[1].转基因动物制备技术

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1、6.转基因技术（Transgenictechnology）6.1转基因与转基因动物概念转基因：1）将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，称之为转基因技术。2）转基因技术就是指利用分子生物学技术，将某些生物的基因转移到其它物种中，改造生物的遗传物质，使遗传物质得到改造的生物在性状、营养和消费品质等方面向人类需要的目标转变。转基因动物是指那些在其所有体细胞基因组内稳定整合着以实验方法导入的外源DNA的一类动物，这类动物由于外源遗传物质的稳定存在而被赋予某种新的表型。这种表型可通过携带外源遗传物质的生殖细胞而传递给子代动物

2、个体。转基因的方法1、DNA显微注射法：将DNA注射到胚胎的细胞核内，再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。2．逆转录病毒感染法：利用逆转录载体将遗传信息以RNA分子的形式，在逆转录整合酶和逆转录基因组末端的特异性核酸序列的作用下，反转录并整合到宿主基因组中去，最终得到转基因小鼠。3．胚胎干细胞法：将转染的胚胎干细胞注射入受体囊胚腔，参与嵌合体的形成，将来出生的动物的生殖系统就有可能整合上外源基因，通过杂交繁育得到纯合目的基因的个体显微注射法建立转基因鼠技术路线1.显微注射DNA的制备与纯化2.鼠的种类、安置与饲养3.超排卵与取卵4.显微注射5.卵的转移

3、6.转基因鼠系的建立实验程序：显微注射DNA的制备与纯化1）酶解、分离与抽提2）氯化铯离心3）收集DNA溶液4）透析与定量2.鼠的种类、安置与饲养3.超排卵与取卵1）超排卵：4~6周母鼠在明暗循环的动物房内饲养3~5天，即可作超排卵。用孕马血清（PMS）模拟卵泡刺激素（FSH）的作用，用人绒毛膜促性腺激素（hCG）模拟黄体生成素（LH）的作用。影响鼠超排卵的因素有：母鼠的种系、周龄与体重，激素应用剂量与注射时间。卵能否受精则取决于公鼠的生殖能力。2）取卵：4.显微注射1）制备持卵管与注射针持卵管的作用是连接负压装置可吸住卵以利注射，注射针是吸入DNA溶液后连接注射器或压力泵将

4、DNA注射入受精卵内，二者均可由1毫米口径的微玻璃管拉制而成。2）显微注射操作倒置显微镜可配用培替培养皿作注射槽，滴1大滴M2培养液在培养皿中心，上面覆盖矿物油。5.卵的转移1）输卵管移卵2）子宫移卵6.转基因鼠系的建立假孕母鼠产出幼仔后，可用幼鼠尾巴提取DNA，对于一些基因调控研究，需要尽快获得信息而暂不需保留转基因鼠，亦可取鼠胚胎提取DNA。从胎鼠组织或幼鼠尾巴提取的DNA，可用PCR、Dotblot（斑点杂交）、Southernblot等多种方法分析以确定是否为转基因鼠用途1.转基因动物生物反应器：生物反应器是指利用转基因活体动物的某种能够高效表达外源蛋白的器官或组织来

5、进行工业化生产活性功能蛋白的技术，这些蛋白一般是药用蛋白或营养保健蛋白。用于表达的生物反应器包括动物血液、泌尿系统、精囊腺、乳腺等，还包括禽蛋和昆虫（例如家蚕）个体等。其中动物乳腺生物反应器是目前国际上唯一证明可以达到商业化生产水平的生物反应器。据预测，2010年世界上动物乳腺生物反应器的年产值将达到500亿美元以上。生物反应器的种类及应用上海医学遗传所转凝血Ⅸ因子基因羊技术路线：2.实验动物模型：研究目的基因在体内表达的调控机制、在动物个体生长发育中的作用，以及某些疾病相关基因改变导致疾病病理表型的分子机制。6.2基因敲除技术基因敲除（geneknockout）:采用同源重

6、组的方法，用体外合成的无效基因或突变基因取代相应正常基因，再应用转基因方法孵育出转基因动物，即为基因敲除动物。应用此技术培育的基因靶向性敲除小鼠是研究小鼠胚胎生成和行为的有力实验系统，也是研究人类遗传基因病的有用模型。①将某基因突变的位点通过同源重组引入小鼠ES细胞。②将含有敲除基因突变位点的ES细胞注入小鼠早期胚胎细胞，孕育出嵌合小鼠。③嵌合小鼠交配后确定其生殖细胞内是否整合有突变的基因位点。④在各只敲除突变基因位点杂合性小鼠之间交配产生纯合性基因敲除小鼠。培育基因靶向性敲除小鼠的主要步骤：Mansur的正负选择系统：构建含有一段与靶基因同源顺序的载体，该同源顺序的1个外显

7、子内插有新霉素抗性基因（NEO）作为正选择的标志，在同源顺序的3’端插有不含启动子的疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）基因的顺序作为负选择，HSV-tk基因由邻近的NEO基因启动子调节。用电转移（Electroporation）法将重组体导入胚胎干细胞，继续作体外培养，并以G418和GANC作双重筛选。因随机插入的DNA通常从头至尾整合入受体细胞DNA中，HSV-tk+基因产物可使GANC转变成一种有毒物质使细胞死亡。如果发生同源重组，由于tk基因在同源区之外不能整合，neor基因在同源区之内得以保留，这