2010-9-2_第四次分子生物学研究方法

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1、2.4PCR(聚合酶链式反应)及其应用目录PCR技术简史PCR的原理PCR过程中的引物设计原则PCR的反应体系和方法PCR中应注意的事项PCR常见问题与对策PCR的类型和应用DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis

2、等因此项技术获诺贝尔化学奖2.4.PCR(聚合酶链式反应)及其应用概念：在引物指导下由酶催化的对特定DNA序列进行的体外扩增反应。由多个循环组成。每个循环包括了变性、退火以及延伸三个阶段。能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍二、PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的PCR反应体系4种dNTP混合物各200umol/L引物　　　　　各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/LPCR循环–第一步–加热变性靶序列靶序列PCR循环-第二步–引

3、物与靶序列退火靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循环-第三步-引物延伸靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase第1个PCR循环完成后–得到两个拷贝的靶序列靶序列靶序列BiotinBiotin30次循环后靶序列扩增的数量No.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201,048,576301,073,741,8241cycle=2Amplicon2

4、cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128AmpliconPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，2～4小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNAPCR循环-第二步–引物与靶序列退

5、火靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循环-第三步-引物延伸靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase①引物长度：15-30个碱基，常为20个碱基左右②引物扩增跨度：以500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜,ATGC最好随机分布④避免引物内部及引物间出现二级结构：特别是3`端⑤引物3`端的碱基要求严格配对：特别是最末及倒数第二个碱基⑥引物中可以加上合适的酶

6、切位点：要作酶切时用⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性三、引物设计原则标准的PCR反应体系4种dNTP混合物各200umol/L引物　　　　　各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L四、PCR反应体系１PCR反应成分(五要素)（1）模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ngDNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。四、PCR反应体系（2）引物浓度0.1-0.5mol/L浓度过高易导致模板与引物错

7、配,反应特异性下降。（3）TaqDNA聚合酶（无3`→5`外切酶活性)0.5-2.5U/50l酶量过多使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。TaqDNA聚合酶的特点TaqDNA聚合酶是从一种极度嗜热水生栖热菌YT-1中分离纯化而得。该酶在70～75℃具有最高的生物学活性，延伸反应通常为72℃。72℃时，酶分子延伸速率在６０个核苷酸每秒以上。TaqDNA聚合酶有良好的热稳定性，测试结果为92.5℃、95℃和97.5℃下，TaqDNA聚合酶的生物半衰期分别为130分钟、40分钟和5~6分钟。（4）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相

8、等浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量dNTP可与