药物蛋白质组学

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1、第三讲药物蛋白质组学Pharmacoproteomics一、概念和研究内容Pharmacoproteomics:proteomicsappliedtopharmacology.药物蛋白质组学：蛋白质组学与药学的学科交叉而逐渐形成新的研究领域。研究内容：临床前：发现所有可能的药物作用靶点以及针对这些靶点的全部可能的化合物应用蛋白质组学方法研究药物作用机制和毒理学临床研究：药物作用的特异蛋白作为患者选择有效药物的依据和临床诊断的标志物应用类似于药物遗传学的方法，按照蛋白质谱来分类患者，给予个体化治疗，并预测药物疗效。运用比较

2、蛋白质组学的策略发现与药物作用相关的蛋白质二、药物作用靶点研究通过研究比较疾病或药物作用的差异蛋白质表达谱，可发现影响疾病或药物作用的关键蛋白或生化途径，再综合分析蛋白质的生物学功能，便可推测新的、潜在的药物作用靶标。直接发现和确认活性小分子药物的药靶：小分子药物直接与蛋白质相互作用的蛋白质组技术，如亲和色谱法、酵母三杂交、蛋白质芯片、噬菌体展示技术、基于蛋白质活性的蛋白质组方法以及结构蛋白组学技术等。药物作用靶点研究策略和方法通过差异表达谱分析发现药物靶标蛋白质活性表达谱（activity-basedproteinpr

3、ofiling,ABPP）分析亲和色谱法(affinitychromatography)直接分离活性小分子的结合蛋白酵母三杂交系统鉴定药物靶点噬菌体展示技术通过差异表达谱分析发现药物靶标2、蛋白质活性表达谱（activity-basedproteinprofiling,ABPP）分析activity-basedprobes（ABPs）：包含结合/反应基团和分析标签（如荧光素）设计的探针分子仅结合蛋白（酶）的活性形式，因此通过测定荧光能间接测定蛋白活性。优点是通过测定酶活性代替测定蛋白的结合或蛋白表达水平PNASAugus

4、t6,2002vol.99no.1610335–10340Nature422,226-232(13March2003)3、亲和色谱法(affinitychromatography)直接分离活性小分子的结合蛋白基本原理：将活性小分子配体的某些功能基团（羧基或氨基）与水不溶性载体（树脂或琼脂糖珠）通过连接臂连接作为固定相，制成亲和吸附柱；然后将蛋白提取液或细胞裂解液通过亲和柱，用缓冲液充分洗涤非结合蛋白，与小分子配基亲和结合的蛋白留在柱上；最后通过干扰配基与靶蛋白相互作用的条件溶液（如蛋白变性溶液或用游离的配基竞争结合）解吸

5、附结合于亲和柱上的蛋白。洗脱出来的蛋白通常可用凝胶电泳法鉴定后再用MALDI-TOFMS分析，或消化成多肽后用液质串联色谱（LC-MS/MS）分析，也可进行免疫分析。成功的例子Yamamoto等应用连续亲和色谱法成功分离和鉴定了免疫抑制剂FK506的特异性结合蛋白FKBP12。AnalBiochem.2006May1;352(1):15-23.Bach等用同样的方法成功鉴定了抗癌药Roscovitine能特异性结合细胞内多个激酶CDK5，ERK1，和ERK2。JBiolChem.2005Sep2;280(35):3120

6、8-19.4、酵母三杂交系统鉴定药物靶点酵母双杂交系统广泛用于研究蛋白质之间的相互作用，在此基础上发展的酵母三杂交系统将应用范围扩展到蛋白质－蛋白质、蛋白质－RNA、蛋白质－小分子化合物等更广阔的研究领域。BD：DNA结合域AD：转录激活域DHFR：二氢叶酸还原酶MTX：甲氨喋呤成功的例子Becker等先通过连接臂聚乙烯乙二醇共价连接CDK抑制剂purvalanolB和MTX，再将此化合物加入表达DHFR-BD融合蛋白和激酶cDNA文库－AD融合蛋白的酵母菌，检测报告基因的表达，鉴定了purvalanolB的已知靶蛋白C

7、DK1、CDK5和CDK6，同时也发现了新的激酶靶蛋白CDC/CDK样蛋白CDC样激酶3(CLK3)、PCTAIRE蛋白激酶1(PCTK1)和PCTK2、丝/苏氨酸激酶p21(CDKN1A)激活的激酶4(PAK4)、核糖体蛋白S6激酶3(RSK3)、非受体酪氨酸激酶FYK和yamaguchi肉瘤癌基因(YES)、受体酪氨酸激酶ephrin受体B2(EPHB2)和fms相关酪氨酸激酶4(FLT4)。ChemBiol.2004Feb;11(2):211-23Licitra应用酵母三杂交系统成功确认他克莫司(FK506)药靶F

8、KBP12(FK506－bindingprotein)ProcNatlAcadSciUSA.1996Nov12;93(23):12817-21三、药物蛋白质学在临床诊断和治疗中的应用应用药物蛋白质组学可筛选出疾病特异性蛋白质，可作为疾病分类分型和临床诊断的标志，还可作为评价药物疗效及预测疾病预后的依据，进而实现药物个