老年期痴呆药2

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老年期痴呆药 一、实验设计的医学基础老年期痴呆主要发生在55岁以上的老年人群中，其临床症状以记忆、思维、判断、计算、识别、语言等脑高级功能明显减退，甚至人格变性，但没有意识障碍，发病缓慢，病程长为特点。据国外统计资料，在65岁以上的老年人中，明显痴呆者占2％-5％，80岁以上者增加到15％-20％，如合并轻、中度痴呆进行估计，则将高于上述数字的2—3倍。老年期痴呆主要包括阿尔海默型老年性痴呆(seniledementiaofthealzheimertape，DAT)和血管性痴呆(vasculardementia，VD)两型。两者可以单独存在，亦有并存，称混合型。其中alzheimer型最为多见，据国外统计资料，约占老年期痴呆的65％，占死亡原因的第四位。其确切的病因尚不清楚。目前有“老年斑学说”，老年斑主要成分为p—淀粉样蛋白(p—amyloidprotein，Ap)，是由淀粉样前体蛋白(amyloidprecursorprotein，APP)产生的；“神经元缺失学说”，主要涉及皮层(额叶、颞叶和顶叶)、海马、基底神经节、下丘脑区，其中以基底节的胆碱能神经元缺失最为明显；“神经纤维缠结学说”，“神经递质异常学说”，主要表现为胆碱乙酰转移酶(ChAT)活性低下，乙酰胆碱(Ach)含量减少，M—胆碱受体密度降低，其他如去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)和许多肽类也常有异常。此外SDAT与遗传和外伤也有关，在SDAT病人亲属中发病的危险性高于一般人群，并发现SDAT组有脑外伤者多于对照组。 有关老年期痴呆的治疗：痴呆早期，应进行及时的对因对症治疗，是可以缓解症状，并能阻止痴呆进一步发展成严重痴呆。西医治疗目前常采用“脑代谢活化剂”如：甲氯芬酯(氯酯醒)、都可喜、喜得镇、活脑灵、吡拉西坦(脑复康)、脑活素等。“改善脑血流药物”如桂利嗪(脑益嗪)、氟桂利嗪·(西比灵)、尼卡地平、尼莫地平、川芎嗪、曲克芦丁(维脑路通)等。常因疗效不满意，毒副反应大或价格昂贵，患者难以坚持用药。中医学认为，老年期痴呆多由下元虚衰，气血匮乏、肾精不足，髓海空虚，脾虚湿滞痰蕴，气虚血瘀情忧等因素所致。病位在脑，与心、肾、肝、脾虚衰密切相关，多属本虚标实证。本虚为气虚髓少，致使行血布津不利，标实为血瘀痰阻致神明失养，清窍不利。辨证分型为“气滞血瘀型”、“髓海不足型”、“痰浊阻窍型”、“肝肾亏虚型”、“脾肾亏虚型”、“心肝火旺型”，治宜用补益药、活血药、化痰开窍药等。 二、药效学研究的实验设计(一)对痴呆动物模型的防治作用试验1．常用动物模型老年期痴呆动物模型常用大鼠或小鼠。．(1)自然衰老动物模型：动物与人相类似，青年期学习快，记忆牢，中老年时学习与记忆能力逐渐下降，有的则发生较严重的记忆衰退或健忘症。小鼠1周岁，大鼠1．5周岁应属早老型；小鼠1．5周岁，大鼠2周岁应属老龄型。用这种动物作实验，其学习记忆能力均比青年鼠、成年鼠低很多。但给药前需要进行筛选，选用学习记忆低下者。此种方法造模容易，但受饲养条件的限制，费时费力，造价较高。且动物身体状况，脑衰退程度与饲养环境关系密切。此种模型应用不够广泛。· (2)给小鼠长时间吸入高浓度的臭氧(O3)致脑衰老动物模型：此模型造模不难，将小鼠放在臭氧发生橱内，每日使其吸臭氧12h以上，连续吸20—30日，即可产生脑功能障碍，同时脑组织脂褐质、过氧化脂质含量增加。但在造模期间，小鼠食量下降，体重明显降低。因为需要特殊设备，此模型应用也不够广泛。(3)给小鼠长期注射D—半乳糖致衰老模型：采用无菌注射方法，每日给小鼠皮下注射5％D—半乳糖o.5ml，连续6—8星期，可致小鼠脑功能衰退且伴有脑组织自由基损伤，使脂褐质、LPO含量升高，B型单胺氧化酶活性增加，此模型造模简单易行，不需要特殊设备，周期不算长，本模型接近自然衰老过程。(4)加速老化小鼠模型(senescenceacceleratedmouse，SAM)：SAM是日本京都大学老年生物学系从美国杰克森研究所移人的AKR系小鼠经过20年开发成功的品种。它具有出现脱毛、被毛粗杂、活动低下、白内障、角膜浑浊、骨质疏松等早期老化特征和寿命缩短的特点。 2．观察方法和指标(1)学习记忆测定方法与指标：小鼠一次性回避性条件反射法(跳台法与避暗法)：小鼠先进行训练，24h再进行测验。以训练及测试时小鼠跳台或避暗潜伏期(s)和3—5min内的触电次数为观察指标，进行组间比较。当给药组潜伏期明显延长，错误次数明显减少时，说明药物有增强学习记忆的作用。试验也可用大鼠。迷路法：进一步分电迷路法和水迷路法。常用复杂水迷路法：多数水迷路含4个盲端，终点有一高出水面的安全区。训练分A、B、C三个起步点进行，每日训练3—5次，连续3-5日不等。训练24h后进行测试，每只动物训练和测试均纪录到达终点的时间(到达时间)和进入盲端的次数(错误次数)，结果进行组间比较。穿梭箱法：穿梭箱分为两等室，两室端点各安有白炽灯，箱底铜栅可以通电，灯光为条件刺激，电击为非条件刺激，大鼠(或小鼠)每日训练3O-6O次。当大鼠于条件刺激时(无电击)就逃向安全室内为主动回避反应阳性。实验以主动回避反应阳性率为指标，进行组间比较。大鼠操作式条件反射：此方法训练难度较大，应用较少。 (2)其他指标的测定与观察：脑生化指标测定：可观测全脑(小脑除外)或相关脑区(皮层、海马和基底神经节)与老年期相关的活性物质如：神经递质和受体：Ach含量、ChAT活性、M—胆碱受体密度；NE，DA的含量。老年期痴呆常有中枢胆碱能和去甲肾上腺素能及DA能神经受损，功能低下的表现。脑组织自由基损伤程度：老年期痴呆常有相关脑区脑组织神经元细胞膜、亚细胞膜自由基损伤明显，表现为脂褐质、过氧化脂质(LPO)含量增加，而处理自由基的酶类，如超氧化歧化酶(SOD)活性降低。脑物质代谢和能量代谢观察：老年期痴呆动物模型常有脑组织蛋白质、核酸代谢低下表现，并有Na+、K+—ATPase，Ca2+、Mg2+—ATPase活性异常等表现。兴奋性氨基酸及其受体水平的估测：兴奋性氨基酸，如谷氨酸、天门冬氨酸含量增加产生细胞毒作用，常可促进脑缺血缺氧病变。 神经细胞和末梢内游离钙离子含量测定：[Ca2+]i超负荷是造成神经细胞损伤的关键环节。[Ca2+]i超负荷可严重损伤神经组织，破坏脑功能。脑病理切片检查：SDAT最显著的病理改变是神经元缺失，神经纤维缠结和淀粉样病变。大脑皮层内大量神经细胞死亡和消失，使神经细胞数量明显减少，可导致脑回萎缩，以额叶((、顶叶、颞叶明显。电镜下可观察到海马和皮层部位神经元纤维缠结成螺旋状或线团状。在神经组织内，脑膜和皮层小动脉内可观察到淀粉样病变。VD则表现为相关脑区出现脑血栓及脑缺血性病理损伤，如水肿或坏死。脑血流量测定：采用多普勒激光血流测定仪或IS—Ⅲ型组织血流仪测定缺血区脑血流量。LTP测定：海马突触传递长时间增强(1Ong—termpotentiation，LTP)效应是记忆巩固过程{中神经元电生理活动的客观指标，是长时性记忆的基础。当用高频电脉冲刺激传人神经时，则引起该神经通路上突触电位效应明显增强。该效应在停止刺激后仍保持较长时间。实验证明，动物记忆强度与LTP反应有明显相关性。 3．方法学评价在神经科学领域中有关老年期痴呆的病因病理尚未搞清楚，老年期痴呆的动物模型建立和药物研究尚不够成熟。在我国有关方面的研究刚处于起步阶段，上述动物模型还不够完善，因此给新药研究带来较多的困难。中药新药研究首先应根据新药功能主治多选用几种模型。如针对SDAT可在前述1-6种模型中选择；针对VD可在后3种模型中选择。学习记忆方法属于行为药理学范畴，观察指标不够精确，标准差大，重复性差，应配合其他方法和指标，如脑的病理检查，选择适当脑生化指标，脑长时程电位测定，脑血流量等多种方法、多种指标综合评价药物的作用。 (二)阳性对照药近年来新批准上市的防治老年期痴呆的中药新药不多，已知的有“抗脑衰胶囊”，由唐山市龙山制药厂生产，主要由补益药、活血药组成，另外还含有维生素E和卵磷脂。2OO1年4月新批准上市的主治血管性痴呆的新药有“九味益脑颗粒”，主要由益气活血药组成。有关西药可选用：“脑代谢活化剂”如：吡拉西坦(piracetam，又名脑复康)，为新型促思维记忆药，可促进大脑对磷脂和氨基酸的利用，增加脑血流量，改善脑缺血及脑损伤。吡硫醇(pyritinol，又名脑复新)，能促进脑内葡萄糖和氨基酸代谢，增加脑血流量。都可喜(duxil)，为烯丙哌三嗪3Omg和阿码碱lOmg混合片剂，本品可改善脑组织氧饱和度，使氧分压增高，且有扩张脑血管作用，促进脑组织葡萄糖的氧代谢，改善脑缺血症状。他克林(tactine)，为中枢AchE可逆性抑制剂，并能激动M胆碱受体，促进单胺递质的释放和更新。烟酸占替诺(脑脉通)，改善大脑新陈代谢，扩张脑血管。此外还有脑活素、喜得镇等。 抗高血压药 一、实验设计的医学基础高血压是指体循环动脉血压升高。一般认为血压增高主要是由于全身小动脉痉挛硬化，引起周围动脉压力增高所致，血容量和心排出量增加也可能参与高血压形成，但虽经多年研究，对高血压确切的发病机制仍无，临床用于治疗高血压的药物一般有①利尿药，中枢a激动剂，节后神经原抑制剂，α阻滞剂；②钙拮抗剂；③β阻滞剂；④血管紧张素转换抑制剂(ACE)；⑤血管扩张剂，N阻断剂。．根据中医理论推断，高血压多眩晕、头痛、心悸、脉弦、中风等症，病位多及心、肝、肾，病因病机虽较复杂，归纳起来不外肝阳上亢，气血亏虚，肾精不足，痰湿内阻，气滞血阏等方面，以肝肾阴虚为其根本。中医治疗主要以平肝潜阳，滋补肝肾，补肾温阳，补肾养心被动风通络为主。 二、药效学研究的实验设计(一)对高血压动物模型的治疗作用试验1．常用动物模型(1)自发性高血压大鼠(SHR)：选择血压高于21．28kPa(160mmHg)以上大鼠进行同系近亲繁殖，多代繁殖后可以获得自发性高血压大鼠(SHR)，血压一般在26．6kPa(200mmHg)左右。此种高血压大鼠首先由日本人培育成功，以后又培育成功一些亚种，如脑卒中易感型自发性高血压大鼠，糖尿病型和肥胖型SHR等，此外还有Smirk等培育成功的新西兰种高血压大鼠(GHR)，由Bianchi等培育成功的米兰高血压种大鼠(MHR)，我国上海高血压病研究所自行繁殖出SHRSP及WKT。Dahi还培育成功盐敏感性高血压大鼠，此种大鼠服用1％盐水后形成慢性高血压，盐不敏感性高血压大鼠在饮用盐水后血压不升高，此种大鼠也是研究降压药常用的病理模型。(2)肾血管性高血压大鼠或犬：狭窄肾动脉造成肾缺血，导致肾生成肾素增加，肾素作用于循环血液中的血管紧张素原，引起血液中血管紧张素工和Ⅱ含量增加。血管紧张素Ⅱ是体内最强的缩血管物质，同时还激活肾上腺皮质分泌醛固酮，引起水盐代谢障碍，造成动物高血压。·(3)内分泌型高血压大鼠：因激素药物造成动物内分泌紊乱，使体内醛固酮增加，水钠潴留，血压升高。 2．观察指标(1)血压：根据不同的实验分别测定动物的正常血压、造模后对照期的血压(1星期以上)、用药前及用药后不同时间的血压，根据不同的模型及受试物的情况决定给药前后测定血压的间隔和次数。测定方法分直接插管测压法和非插管间接测压法，前者可连续观察给药前后MAP，观察血压波型和ECG，心率，多用于各种动物的急性实验；非插管间接测压法主要用于大鼠和犬，是常用的测压法，多用于慢性实验。(2)ECG：观察QRS波、T波、ST波、心率和心律。(3)急性降低血压2．66—3．33kPa(20-25mmHg)的剂量，和已知定量比较，若有加快心率作用，求出加快心率的剂量。(4)血流动力学指标：可在高血压动物模型上测定血流动力学指标，泵血功能主要以CO(心输出量)、CI(心脏指数)代表，收缩功能主要以LVdp／dtmax(左室压力上升和下降速率)代表，前负荷以LVEDP(舒张末期压)代表，后负荷以BP(血压)、TPR(总外周阻力)代表，器官血流、脑血流主要以颈内动脉血流为代表，心脏血流以冠状动脉左前支血流为代表，外周血流以股动脉血流为代表，必要时须测肾血流。 3．方法学评价(1)自发性高血压模型(又称遗传性高血压模型)较接近人类原发性高血压，是迄今研究人类原发性高血压较为理想且首选的动物模型。我国自行繁殖出的SHRSP、SHRSR及WKT已成为研究高血压发病机制及筛选降压药物较好的动物模型，并应用于中医阴阳虚证学说的研究。在多种高血压模型中，国外SHR、DS、MHS应用较广，在我国以SHR、SHRSP应用较多，其余因血压比SHR、SHRSP低，且少见有心血管并发症故少用。自发型高血压动物虽与人类高血压病十分类似，但也存在不少差异，因此在动物体上得到的结果推论到人类高血压时应慎重。(2)用狭窄肾动脉的方法能形成稳定持久的高血压，相当于人的肾血管型高血压，能反映受试降压药的效力，是主要用于评价降压药药效的良好病理模型。狭窄肾血管引起的高血压有二肾一夹型，其中一肾的功能保持；还有一肾一夹型，切除健康肾，肾脏的排水功能受到损害。 (3)插管直接测压的方法简单，准确，能连续观察给药前后的血压和心率、心律、ECG，了解一次给药后药物出现作用和作用消失时间、作用强度，并与已知药比较，作出科学评价。其缺点是不能进行长期慢性实验。(4)间接压法在新药研究中可用于降压药筛选和药物治疗作用规律的研究，主要用于大鼠和犬，最常用的方法是大鼠尾动脉袖带加压法，可分别于动物给药前后定时测定，以观察不同阶段药物的作用规律或多次给药后血压的变化情况，可进行长期慢性实验。该法的优点是简便、快速，可多次测定，缺点是受室温、加温温度及时间因素影响较大，血压有波动，常以几次测定的平均值代表。(5)对受试的降压药，常需做高血压动物治疗试验、清醒高血压动物急性降压试验和流体动力学试验。高血压动物治疗试验一般为慢性试验，主要观察高血压动物用药前后、用药期间血压的变化情况以及停药后血压的恢复，常给造模动物用药若干疗程，定时观察各项指标。清醒高血压动物急性降压试验主要了解一次用药前后各项指标的变化情况，测定方法可采用间接测定和直接测定，尤其以后者为好，可观察药物的时效过程。血流动力学试验可选用高血压动物或正常动物为受试对象，但应注意很多降压药对正常动物血压无明显影响。4．给药方法受试药给药方法中至少有一种与临床相同，如果插管影响口服给药，可采取经胃或十二指肠给药。如果受试药为中药提纯物，水溶者可用静注或其他注射方法，如系中药粗制剂一般不宜直接静脉注射。 (二)其他试验(1)血流动力学试验：正常动物用药前后的血流动力学试验一般用狗，可以同时测定多项指标。在戊巴比妥麻醉下，分离颈总动脉、颈外动脉、股动脉和股静脉。左侧开胸分离冠状动脉左旋支、主动脉上升支。结扎颈外动脉和椎动脉后在颈总动脉、冠状动脉、股动脉和升主动脉上放置电磁流量探头即可分别测定这些血管的血流量，以主动脉流量代表心输出量。股动脉插管到腹主动脉，测定中心动脉压。四肢皮下插针型电极，测ECG。从心尖将导管插入左心室测心室收缩压(LVSP)和舒张末期压(LVEOP)。经微分标出左室压力上升和下降速率(LVdp／dtmax)。泵血功能主要以CO(心输出量)、CI(心脏指数)代表，收缩功能主要以LVdp／dtmax代表，前负荷以LVEDP代表，后负荷以BP、TPR(总外周阻力)代表，器官血流、脑血流主要以颈内动脉压血流为代表，心脏血流以冠状动脉左前支血流为代表，外周血流以股动脉血流为代表(必要时须测肾血流)。麻醉大鼠从右或左颈动脉插管至左心室，也可同时测血压、ECG、LVSP和LVdp／dtm~。 (2)根据中医辨证分型的特点，可选择性观察一些相关指标：例如治疗肝阳偏亢高血压的药物，可观察垂体—肾上腺轴内分泌的变化，如儿茶酚胺、17—羟皮质固醇等；治疗阴虚阳亢高血压的药物，进行交感—β受体—环核苷酸系统功能水平的测定，必要时可测血内肾素、血管紧张素、cAMP／cGMP等。(3)药物作用机制的研究，可选做离体血管条试验以观察药物对血管收缩性的影响，也可根据情况选做一些对受体、离子通道影响的试验。(4)重要脏器的血流量(心、脑、肾等)观察。(5)利尿、血容量测定；镇静(针对头痛、眩晕)等作用观察。 (三)阳性对照药阳性对照药既可以选西药，也可以选中药，西药作用机制较明确，效果肯定，中药在辨证分型治疗方面有独到之处，可根据受试药物的药效特点，选择作用功效或机制相近疗效肯定的中药中成药或西药为阳性对照药，给药剂量与临床用量及受试药剂量相对应(等效量或倍数量)。 消化性溃疡药 一实验设计的医学基础消化性溃疡主要指发生于胃和十二指肠的慢性溃疡，临床以上腹部剑突以下，脐以上胃腕部经常发生疼痛为主症。本病属中医“吞酸”、“胃脘痛”之范畴。有关消化性溃疡病的病因病机尚未完全清楚。一般认为溃疡的形成主要由于胃、十二指肠黏膜的防御因素和攻击因素的平衡失调所致。攻击因素主要是指胃酸、胃蛋白酶以及近年提出的幽门螺旋杆菌；防御因素则包括粘液——碳酸氢盐屏障、胃黏膜血流、胃上皮更新和内生性前列腺素等。任何原因导致攻击因素加强和(或)防御因素减弱时，均可导致溃疡发生。现代医学刘消化性馈疡的治疗般可分为三个方面：抑酸、强化黏膜防卫和抗菌治疗。中医认为本病的病因病机主要有情志所伤，饮食劳倦等方面。本病病位在胃，与肝、脾关系最为密切。在病机转化方面，具有由气及血，由实转虚，寒热转化、化热伤阴之特点，临证多从肝郁、脾虚，胃热、气滞、血淤及胃阴亏损进行辨证，采用疏肝、健脾清热、理气、化瘀，养阴之法。 二、药效学研究的实验依据(一)对溃疡病模型的防治作用试验1．常用动物模型(1)应激性胃溃疡模型：通过应激的力法引发，如束缚、冷冻、饥饿、烫伤等。(2)幽门结扎法溃疡模型：通过手术结扎幽门的方法而形成溃疡。(3)药物性溃疡模型：如利血平溃疡模型、吲哚美辛溃疡模型、阿司匹林溃疡模型均通过相应药物的作用而产生溃疡，(4)化学性溃疡模型：慢性乙酸溃疡模型、无水乙醇、盐酸、氢氧化钠溃疡模型，这些模型均为这些物质直接损伤胃黏膜而形成溃疡。以上溃疡模型，除乙酸溃疡模型外，其余均为急性溃疡模型，前者通常作为观察药物对溃疡的愈合作用，后者则作为观察药物对溃疡发生情况从程度的影响 2．观察指标(1)溃疡愈合情况应足评价新药疗效的最主要指标。这通常足对慢性溃疡模型而言。衡量溃疡愈合的指标有溃疡疡面积或溃疡体积、溃疡愈合率。哪中表示更为科学，应根据药物作用强度以及溃疡愈合程度而定。(2)溃疡指数及溃疡发生率常作为评价药物对各种溃疡模型作用的指标。特别是对急性溃疡模型。前者常为评价溃疡的轻重程度，后者则衡量溃疡发生情况。溃疡指数的评定标准与方法视不同的溃疡模型而有所不同。(3)其他可供分析的指标：胃黏膜出血程度，急性溃疡模型如应激溃疡、药物性溃疡、化学致坏死性损伤物质引起的胃黏膜损伤常为出血性损伤，其出血的程度与胃黏膜损伤程度相关。但由于实际操作上不易测量出血量，可以“+”分级表示轻重程度，作为辅助指标。 3．方法学评价上述各种溃疡模型，由于造模方法和发生机制不同，模型中各有特点。可根据新药的功能主治灵活选择。(1)慢性乙酸法溃疡模型：一般认为其溃疡的病理形态特点与修复过程类似人类消化溃疡。且溃疡发生率达1OO％，溃疡在胃肠任何部位均可造成，溃疡持续时间长，自愈约需6O—1OO日，可在较长时间内观察药物治疗的效果等，因此，该模型适用于各种证型药物的观察。是评价药物对溃疡愈合作用的较为理想的溃疡模型。(2)幽门结扎法溃疡模型：其主要发生机制为潴溜的胃液对胃的消化作用以及由于结扎幽门引起胃的血液循环障碍所致。与人类消化性溃疡的“自身消化”学说相吻合，与中医的气滞血瘀有一定的联系。由于操作方法简单易行，溃疡发生率高，几乎达1OO％，因此广泛用于抗溃疡药物研究，适合于各类证型抗溃疡药物，特别是活血化瘀、理气行气类药物的抗溃疡作用观察。 (3)应激性溃疡模型：与人类应激性溃疡十分相似，此模型的发生机制比较复杂，一般认为应激作用使大脑皮层中枢的兴奋与抑制过程失调，引起皮层下中枢功能紊乱从而导致自主神经和下丘脑—垂体—肾上腺皮质轴的调节功能紊乱，使胃肌痉挛、胃血液循环障碍，胃分泌增加而导致溃疡形成。人类由于严重创伤、烧伤等可产生急性应激性溃疡，精神过度紧张，强烈的情绪激动也可导致溃疡的发生或复发。与中医肝郁型患者中枢及自主神经系统功能紊乱有一定的联系。因此该模型适合于疏肝理气、疏肝清热、活血化瘀类药物的观察。(4)利血平溃疡模型：其可能机制是由于其刺激5—HT和(或)组胺的释放，或激活ACTH—甾体类激素的释放，引起过多的胃液分泌以及胃壁的血管运动变化。此模型的优点是操作简单、发病率高，缺点是溃疡比较表浅。适合于各类证型，特别是脾胃虚弱型之益气健脾药物的观察。(5)吲哚美辛、阿司匹林溃疡模型：其主要机制是抑制胃黏膜细胞内前列腺素系统，与细胞保护作用减弱有关。它的优点是溃疡发生率高，再现性好，缺点是溃疡比较表浅，适合于各种证型药物的观察。(6)强酸、强碱、无水乙醇引起的溃疡模型：其发生机制为直接损伤胃黏膜而形成溃疡。此类模型较偏重于有关加强胃黏膜防卫作用药物的试验。适用于清热、解郁、益气健脾、益气养阴等类药物的观察。 (二)其他试验1．胃分泌试验抑酸常是消化性溃疡药物的作用环节之一。可观察药物对胃酸、胃蛋白酶分泌的影响，包括胃液分泌量、游离酸度、总酸排出量(单位时间内)、胃蛋白酶排出量。常用方法有大鼠幽门结扎法收集胃液进行分析，也可以采用在体胃灌流法等。2．胃黏膜血流量胃黏膜血流不仅在胃黏膜的防御机制中起着重要的作用，而且对溃疡病灶的修复也必不可少，因此，测定药物对胃黏膜血流量的影响，也可作为药物药效的辅助指标之一。胃黏膜血流量的测定需要掌握——定的技术和一定的仪器设备。常用的方法有中性红清除法、多普勒激光血流测定法、氢离子廓清法等。 3．胃黏液测定胃黏液屏障在胃黏膜抗损伤中起到第一道防线的作用，是胃黏膜的防卫因素之一。中药治疗消化性溃疡的作用之一有可能是通过影响胃鞘液的分泌。因此，观察药物对胃黏液含量的影响也可作为药效研究的辅助指标。通常采用阿利新兰糖蛋白结合法分别测胃壁结合黏液的含量以及胃液中游离黏液的含量、以胃壁结合黏液较有意义。4．抗炎镇痛试验炎症是消化性溃疡病常见的病理特征之一，疼痛往往由炎症引起。具有消炎、止痛作用的药物有利于溃疡病灶的修复，可以选择一些炎症模型如腹腔毛细血管通透性模型、炎症耳肿胀模型、足肿胀模型；疼痛模型如醋酸扭体、热板法、解痉试验等作为药效辅助指标。5．抑制幽门螺旋杆菌试验幽门螺旋杆菌是消化性溃疡病重要的致病因素之—。有条件也可以观察药物对该茵的抑制作用。 (三)阳性对照药阳性对照药既可以选西药，电可以选用中药。西药的作用较明确，效果较肯定。常用有U2妥体抽抗剂如西咪替丁、雷尼替丁、法莫替1—等；加强胃黏膜防卫功能的有生冒酮、硫糖铝等。中成药品种较多，—‘般应选择疗效较旨定的主治功能相似的中成药作为对照药，对照组应是药典记载的。对照药剂量应与受试药的剂量相呼应(等效量或给药倍数相等)，以资比较。 糖尿病药 一、实验设计的医学基础糖尿病是一组全身性的内分泌代谢性疾病，主要表现为高血糖症。人类糖尿病分型主要有：1型(以往称胰岛素依赖型)糖尿病，是由于胰岛β细胞破坏，胰岛素分泌减少(绝对缺乏胰岛素)所致体内糖、脂肪、蛋白质及水盐等代谢紊乱；2型(以往称非胰岛素依赖型)糖尿病，是以胰岛功能缺陷，即胰岛β细胞的胰岛素分泌缺陷，及胰岛素的作用缺陷，即胰岛素抵抗为病理生理基础所导致体内代谢紊乱。1型和2型糖尿病在病因和发病机制上虽不相同，但都是由于遗传因素和环境因素共同作用而发病。在综合治疗措施中，1型患者必须应用胰岛素，2型患者除部分人需用胰岛素外，多数人用口服抗糖尿病药治疗。近20年，对糖尿病的病因、病理生理等研究的深度和广度都有很大进展，因此，口服抗糖尿病药物也有相应的发展，除原有刺激胰岛素分泌作用(如磺酰脲类)及加强外周糖的利用(如双胍类)降血糖药物外，不断有新类型的药物问世，或正在临床试用。如胰岛素增敏剂、糖苷酶抑制剂、醛糖还原酶抑制剂及糖化蛋白抑制剂等。 消渴病是中医学的病名，消渴病的临床表现和西医糖尿病相当一致，中医认为消渴病为热盛阴伤之病，由于燥热偏盛，阴津亏耗，燥热可以伤阴，阴伤又可以加重燥热，两者恶化后导致消渴病的发生。病程发展的特点是，初期为阴虚热盛，中期为气阴两虚，后期为阴阳两虚。中医治疗消渴病的治则是，滋阴清热，益气养阴。重视补肾、健脾及活血化瘀等。近年来，通过中药药效学及临床研究证明，多数中药直接降血糖作用不及西药，起效也不如西药快，但中药根据上述治则组方，可发挥中药的综合作用，也可起到标本兼顾的积极治疗作用。参考近年对糖尿病患者具有胰岛素抵抗综合征特点，及高血糖诱发体内糖基化蛋白水平升高及多元醇代谢途径活跃等导致糖尿病并发症的新观点，发掘消渴中药药效的特点，从而找到中西医在防治糖尿病(消渴病)的契合点，是探讨和促进中西医结合，防治糖尿病，具有广阔前景的有效途径。 二、药效学研究的实验设计、(一)糖尿病动物模型为了研制各种类型新药的需要，国内外已经或正在建立相应的动物模型。按人类糖尿病分型，大致可分为类似1型和2型糖尿病动物模型及糖尿病并发症的动物模型。以下做一简要介绍。1．类似1型糖尿病的动物模型(1)化学物质特异破坏胰岛β细胞：常用链佐星(链脲菌素streptozotocin，简称STZ)或四氧嘧啶(alloxan)诱发动物高血糖。由于方法简便，形成率高，是最常用的动物模型。但有刺激胰岛素分泌作用的药物及胰岛素增敏剂对此模型无降糖反应。(2)自发性糖尿病动物：这种动物有自家免疫病因参与，胰岛β细胞受损，因而胰岛素缺乏，血糖升高。常用于研究1型糖尿病的病因及病理生理等。如中国地鼠、BB大鼠及NOD小鼠等。有的尚需国外进口，此类动物要求较严格的培育和饲养条件。 2．类似2型糖尿病的动物模型(1)实验性肥胖及糖尿病大鼠模型：给木鼠注射小剂量STZ，造成胰岛β细胞轻度损伤，使多数动物产生糖耐量异常，在此基础上，给动物喂高热量饲料，10星期以后，动物可有肥胖，并伴有高血脂、高胰岛素血症及胰岛素抵抗。此模型形成率约，为70％。胰岛素增敏剂显示阳性结果。(2)胰岛素抵抗型自发性糖尿病动物：这类动物多数肥胖，有高胰岛素血症，类似人类2型糖尿病的特点。女口db／db、ob／ob、T—KK、Yellow—lcd(、NZO／J、鼠、ObeseZucker、Goto—Kak，izaki(GK)、SHR／N—cp、OtsukaLong—EvansTokushimaFatty(OLETF)大鼠等。国外开发口服抗糖尿病及并发症的新药多选用这类动物。多数动物需从国外引进，由于饲养条件要求高，动物价格昂贵，尚难被广泛应用。．(3)MSG肥胖大鼠：以大剂量L—谷氨酸钠(MSG)给新生大鼠皮下注射，损伤下丘脑，引起肥胖，由此诱发高血脂、高胰岛素血症及胰岛素抵抗。胰岛素增敏剂显示阳性结果。 3．高血糖、高血脂金黄地鼠模型金黄地鼠的脂质代谢与人有许多相似之处。与人类类似，其肝VLDL只含有APOBlOO，血浆中有胆固醇酯转移蛋白的活性。给金黄地鼠饲以高脂饲料引起的冠状动脉损伤，在病理学上与人类动脉粥样硬化形成早期相似。以小剂量STZ给金黄地鼠注射，可使血糖、血脂同时高。形成糖尿病动物兼有脂肪代谢异常的模型。4．糖尿病并发症动物模型糖尿病的慢性并发症是严重影响患者生命质量及致残致死的原因，其主要病理改变是微血管和大血管病变，前者涉及糖尿病性神经、肾及眼病变；后者涉及心脑血管系统的并发症。近年来，根据研制防治糖尿病并发症药物的需要，国内外学者建立了相应的动物模型。主要是应用上述类似1、2型糖尿病动物在较长的病程中发展为并发症，以微血管为主。如以STZ诱发高血糖大鼠的神经、肾及眼底病变；以蔗糖诱发SHR／N—cp大鼠的肾病；以半乳糖形成大鼠的糖性白内障等。建立糖尿病并发症的动物模型需时长，如形成动物眼底病变需时1～2年或更长，因此动物应在特定的条件下培育与饲养。 (二)非特异性动物模型1．高血脂动物模型在评价降血糖药的降血脂作用时，可选用常用的高血脂动物模型。用高胆固醇乳剂给小鼠或大鼠灌胃，连续1星期可使动物血胆固醇升高。也可将胆固醇与食物相混，给家兔喂食，引起家兔血胆固醇及三酰甘油(甘油三酯)升高，这类模型文献报道很多。2．正常动物在评价具有刺激胰岛β细胞分泌胰岛素作用的药物，用类似1型糖尿病的动物模型，会得到阴性结果，但此类药物可使正常动物血糖降低，故选用正常成年动物(大鼠或小鼠)，禁食2-3h，即可进行实验。 (三)观察指标2型糖尿病及其慢性并发症的发病机制非常复杂，抗糖尿病药物的作用机制也异。因此可根据所试药物的作用机制或特点，选择合适的指标以阐明试药的抗糖尿病作用。1．有关糖代谢的指标(1)降血糖作用的量效和时效关系测定：在一定范围内，药物剂量大小与降血糖作用的强弱成正比。剂量太小往往无效，剂量过大可能会出现低血糖休克等。量效关系测定可定量地分析阐明药物剂量与降血糖效应之间的规律。一般实验设计为给药组(3个剂量)、阳性对照药组、对照组。根据试药的作用特点，选用正常动物或高血糖动物，在阳性对照药选择上尽量选用与试药作用相近的上市药物，对照组给等体积的水或赋形剂；给药后一定时间采血样测定血糖(常用葡萄糖氧化酶法)水平。药物进入机体产生降血糖的效应受多方面因素的影响，如药物本身、给药途径、给药时间、药物的体内过程等，以致药物在药效作用出现的快慢、药效作用维持时间等方面不同。时效关系的测定可定量地分析药效的动态变化。一般实验设给药组、阳性对照药组、对照组。在给药后不同间隔时间采血样，测定血糖水平。以血糖变化为纵坐标，时间为横坐标可绘出时效曲线。 (2)糖耐量测定：糖耐量包括单糖、双糖、多糖的耐量，可根据试药的作用特点，选用肯适的动物模型及糖的种类，一般用葡萄糖(腹腔注射1．5—2．Og／kg，口服2．O—2．5g／kg)，如试药具有抑制。—葡萄糖苷酶活性作用，可用淀粉(口服3．O-5．Og／kg)和／或蔗糖(口服3．O-5.Og／kg)。实验设计先取禁食动物血样为零时，给糖负荷后不同间隔时间(如3O、6O、12Omin)采血测定血糖值或计算血糖曲线下面积(AUC)。给药及给糖时间可根据试药的特点而定。(3)糖化蛋白水平：蛋白质在高糖环境中发生非酶糖基化形成糖化蛋白，继而引起一系列病理改变，这是糖尿病某些慢性并发症发生发展的主要环节之一。糖化蛋白一般指糖化血红蛋白和糖化血清白蛋白(果糖胺)，其含量与血糖浓度成正比。根据白蛋白的半衰期(2星期左右)和红细胞的寿命(2-3个月)，果糖胺和糖化血红蛋白的含量可反映近2-3星期和近2—3个月左右的血糖水平，其含量测定不受血糖暂时波动的影响。糖化血红蛋白测定原理随测定方法不同而异，其测定方法有比色法、亲和色谱法、离子交换色谱法、电泳法和高效液相法等。 (4)糖原合成和糖异生：糖原是由许多葡萄糖组成的带分支多糖。人体血液里的葡萄糖除氧化供能和转化成其他化合物以满足机体的正常需要外，多余的葡萄糖在一系列酶的作用下合成糖原，储存于肝脏、肌肉，以备在血糖下降时动用来维持血糖的相对稳定。糖尿病时，机体内糖原合成过程中的某些酶活性低下，糖原合成减少而导致血糖升高。一些抗糖尿病药物可通过改善或增强糖原的合成使血糖降低。糖原合成测定方法常用葸酮法，一般测定肝糖原含量，也可测定肌肉中肌糖原的含量。由非糖物质如氨基酸、乳酸、甘油和丙酮酸转变为葡萄糖和糖原的过程称为糖异生。其生理意义是在饥饿状态下，保证血糖浓度的相对稳定。糖尿病时，三大代谢紊乱，血中非糖物质增多而糖异生增强，使血糖水平处在较高水平，某些降血糖药物能抑制糖异生过程使血糖下降。一般实验设计·为，动物禁食较长时间(1O-12h)后，给予非糖物质，经糖异生作用动物血糖将升高，通过测定动物血糖的变化，可观察糖异生作用的强弱。如用雄性昆明小鼠禁食12h后，腹腔注射L—α—丙氨酸(2g／Kg)，测定O、6Omin的血糖。糖原合成及糖异生也可用离体肝细胞进行测定。 (5)血胰岛素水平：测定血清或血浆中胰岛素含量有助于判断试药治疗糖尿病的主要作用机制，如磺酰脲类降血糖药，由于刺激胰岛β细胞分泌胰岛素而使血胰岛素水平升高；双胍类降血糖药主要作用于外周组织，所以对血胰岛素几乎无影响；胰岛素增敏剂类抗糖尿病药物，由于主要在于改善组织细胞对胰岛素的敏感性而使血糖降低，可使具有胰岛素抗性的动物高胰岛素水平下降。血胰岛素水平测定常用竞争放射免疫分析法(试剂盒)；近年也有用ELISA法，价格较贵。(6)血乳酸水平：乳酸是葡萄糖代谢的中间产物，由丙酮酸还原生成。血浆乳酸的浓度取决于糖酵解的速度以及乳酸被利用的快慢。某些降血糖药物可增加糖的无氧酵解使血乳酸浓度升高，在有些情况下，可导致乳酸性酸中毒。血乳酸水平测定可用乳酸脱氢酶法或比色法，其原理分别为，利用乳酸在乳酸脱氢酶的作用下，辅酶工量的变化间接测定乳酸的量；乳酸与浓硫酸共热使乳酸变成乙醛，然后在铜离子的存在下，与对羟基联苯起反应生成紫红色后进行比色测定。 2、对胰岛素的反应性机体对胰岛素的反应性低下或对胰岛素不敏感称为胰岛素抵抗。随着对2型糖尿病发病机制研究的深入，胰岛素抵抗是其主要的病理基础。近年来，针对2型糖尿病的发病机制，寻找增加机体对胰岛素敏感性的药物成为抗糖尿病药物研究的热点，目前已有胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类衍生物罗格列酮、匹格列酮等在一些国家上市。因此，在开发抗糖尿病药物研究中，测定机体对胰岛素的反应性具有重要意义，试验应选用具有胰岛素抗性的动物。(1)胰岛素耐量实验：主要测定动物对外源性胰岛素的敏感性。试验设模型对照组、试药组、正常动物组，动物禁食2—3h后取血样(零时)，皮下注射一定剂量的胰岛素，于注射后一定间隔时间(如4Omin、9Omin、15Omin)采血，测血糖值。以血糖值或血糖变化百分数为纵坐标，时间为横坐标作图，并可计算血糖曲线下面积，判断试药是否能改善动物对外源性胰岛素的反应性。(2)血糖钳法：血糖钳技术被公认为是评价机体胰岛素抵抗的金指标，其原理是输注胰岛素以使血胰岛素维持在一个高水平，以抑制内源胰岛素分泌。同时输注葡萄糖以维持血糖水平在基础线上，由于输注的高胰岛素使血糖不断代谢，要维持血糖在基础水平，须不断调节葡萄糖输注速率，当输注速率与代谢速率达到平衡时，葡萄糖输注速率就等于体内组织在外源胰岛素的作用下摄取代谢葡萄糖的速率。所以，血糖钳葡萄糖输注速率(GIR)反映组织对外源性胰岛素的敏感性，GIR值低，敏感性就低，否则反之。 3．对血脂的影响无论1型或2型糖尿病患者，往往出现脂质代谢异常。因此测定血脂或肝脂含量可判断试药是否在改善糖代谢异常的同时，对脂质代谢也有改善作用。目前有商品试剂盒可用于血胆固醇、肝或血的三酰甘油(甘油三酯)、高密度及低密度脂蛋白含量的测定。(1)血胆固醇水平。(2)肝或血的三酰甘油(甘油三酯)水平。(3)高密度及低密度脂蛋白。 4．醛糖还愿酶的活性测定醛糖还原酶是多元醇途径的限速酶，对葡萄糖的Km值较高(7Ommol／L)，故血糖正常时其活性非常低，但在糖尿病血糖异常升高时，一些不依赖胰岛素进行糖摄取的组织中，醛糖还原酶的活性被激活。多年的研究认为，醛糖还原酶活性增高在糖尿病的慢性并发症的发生发展过程中起了非常重要的作用。因此，用该酶可测定各种醛糖还原酶抑制剂的离体作用。醛糖还原酶可从牛、大鼠等晶状体提取，以DL—甘油醛为底物，由于反应中用NADPH，因此酶活性以34OnmOD值变化来表示.测定不同浓度试药的抑制百分率，并计算出IC5o值。也可以用半乳糖大鼠或链佐星糖尿病大鼠，给予醛糖还原酶抑制剂治疗后，晶状体中醛糖还原酶、NADPH、NADP’含量与对照组比较，可评价醛糖还原酶抑制剂的作用，酶活性以每分钟NM)PH氧化的nM表示。 5．α—葡萄糖苷酶的活性测定。α—葡萄糖苷酶存在于小肠黏膜绒毛的刷状缘。碳水化合物进入小肠后，必须在该酶的作用下水解为单糖才能被吸收，表现为餐后血糖快速升高，这种现象对糖尿病病人是不利的。自2O世纪6O年代起，不少学者根据糖尿病控制饮食的治疗原则，研究碳水化合物消化酶的抑制剂，目前已有。α—葡萄糖苷酶抑制剂在临床上得到广泛应用。一般用大鼠、犬或猪上段小肠黏膜制备。α—葡萄糖苷酶，然后与不同底物温孵，终止反应后，通过测定反应体系中葡萄糖的生成量，可判断试药对该酶活性的抑制作用，并计算出IC5O。也可用反转肠囊技术评价试药对。α—葡萄糖苷酶的抑制作用。 6．有关主要并发症的指标(1)血液生化测定：山梨醇测定：山梨醇是多元醇途径的中间产物，它不能自由出入细胞而导致在细胞内大量堆积。通过对组织细胞中山梨醇含量的测定，可了解多元醇途径的活跃程度。测定方法包括化学法和酶法两种。Na／—K—ATP酶活性测定：糖尿病患者或糖尿病模型动物的许多组织中如红细胞、神经纤维、心脏、肾脏、视网膜、晶状体、血管内皮等Na—K—ATP酶活性均有改变，在糖尿病慢性并发症的发生发展中的作用越来越引起人们的重视。测定原理为，在含Na、K、Mg的缓冲液中，加人三磷酸腺苷和所制备的膜酶，在37℃温育一段时间后，三磷酸腺苷被酶解成二磷酸腺苷和无机磷。以每毫克膜酶蛋白每小时新产生的无机磷量为酶的活性单位。谷光甘肽、脂质过氧化物质、抗氧化酶活性测定：糖尿病时血糖增高，蛋白质非酶糖激化增强，而体内糖及糖化产物的自氧化反应产生氧自由基，使体内活性氧升高，同时糖尿病时体内抗氧化酶的活性降低，因而对氧自由基介导的机体损伤非常敏感，由此促进了糖尿病某些慢性并发症的发生发展。目前可通过对谷光甘肽、脂质过氧化物质、抗氧化酶活性的测定，评价试药的作用。 血小板聚集测定：测定血小板聚集的方法很多，如比浊法、比值法和血栓法等，但比浊法最常用，其基本原理为，富含血小板的血浆具有一定浊度，浊度的高低与所含血小板数目相关，当加入诱导剂后，在搅拌条件下，部分血小板聚集而浊度下降，透光度增加。可通过血小板聚集仪将其浊度的变化描记成曲线，求出血小板聚集的程度，以判断试药是否改善糖尿病状态的血小板聚集性异常。肾功能测定：糖尿病肾病变是常见的糖尿病并发症之一，因此对能反应肾病变的指标进行测定，如尿微量白蛋白、尿N—乙酰—p—D氨基葡萄糖苷酶、尿1微球蛋白等，可评价试药对糖尿病肾病变的预防和治疗作用。肝功能测定：肝脏在糖代谢中起着关键的作用，对于机体内糖的储存、分解和血糖调节等方面至关重要。糖尿病患者可有肝脏轻度肿大、脂肪肝等，出现肝功能异常，因此在新药研究开发时，对肝功能的测定也有重要意义，可评价试药对糖尿病的治疗作用及毒副反应。 (2)血液流变学：许多糖尿病慢性并发症与血液流变学的改变关系十分密切，通过血液流变学指标的测定以评价试药的作用和特点。(3)神经传导速度测定：糖尿病神经病变是常见的糖尿病慢性并发症之一，其发病机制尚不完全清楚，可能与缺血、山梨醇途径活跃、自由基应激以及轴索变化等有关。病理改变多见于周围神经系统和自主神经系统，神经传导速度(运动、感觉)减慢。因此测量糖尿病动物神经传导速度对观察药物对神经损伤的影响有重要意义。以链佐星形成糖尿病大鼠模型，用改良的ShatmaAK(1974)方法，测定坐骨神经—胫骨神经的传导速度。两根细铂刺激电极插入坐骨神经切迹；两根细铂刺激电极通过邻近胫骨神经的踝皮肤插入。电极相距5mm，远端为阴极。记录电极插入足侧面皮肤，另一电极插入三和四趾之间，地线电极插入足背皮肤。用神经生理装置进行刺激和记录。用持续O．1ms的方波脉冲最大限度地刺激神经，通过两刺激点潜伏期不同而分开的远端电极之间的距离，计算神经传导速度，取三次记录的平均值。通过对每一处理组的一只大鼠测定神经传导速度6次，每次取出和插入电极，计算神经传导速度的变异系数。 (4)痛觉或温觉：糖尿病并发神经病变时，动物的痛觉或温觉也出现异常，可用甩尾法或热板法测定，给药组与对照组进行比较以判断药物的预防及治疗作用。(5)晶体混浊度(白内障)测定：已知糖尿病病人白内障的发病率增加，如晶状体透明度或屈光指数的变化。有证据表明，在糖尿病白内障发生中，涉及多元醇代谢和醛糖还原酶。糖性白内障的形成与晶状体多元醇堆积相平行。由于多元醇不易通过完整细胞膜而扩散，造成晶状体细胞内严重的渗透应激，而导致细胞肿胀，细胞膜失去了其完整性。实验表明醛糖还原酶抑制剂可预防糖性白内障的形成。试验用链佐星糖尿病大鼠，给予试药滴眼液滴眼以代替全身给药，每日两次共6星期，一般每星期测两次血糖。每两星期用裂隙灯或Scheimpflug摄影术分析对白内障变化进行分级。用试药治疗动物的数据与模型组进行比较。以判断试药的作用。 (6)病理观察：糖尿病动物模型中，除发生各种代谢变化外，各有关脏器也发生一些特有的病理变化，研究这些病变，对评价试药的疗效有重要意义。根据所观察的脏器，进行适当的取材、固定、包埋、切片、染色，用于光镜或电镜观察。胰岛：不同动物模型其病理改变各异，如胰岛炎、胰岛p细胞变性、脱颗粒、坏死，胰岛肥大、日细胞增生数目增多，胰岛损伤后，胰腺导管上皮细胞及部分腺泡上皮细胞增生并化生为胰岛p细胞。肾脏：肾小球毛细管基底膜增厚，管腔狭窄，PAS染色增厚的基底膜染成红色，电镜可见增厚的基底膜由纤细的糖蛋白微纤维构成；肾小球系膜增宽电镜可见胶原纤维及细胞外纤维样沉积物沉积在基底膜与内皮细胞之间，内皮细胞内可见脂滴。 痹证药 一、实验设计的医学基础中医学认为痹证系指人体营、卫、气、血失调，风、寒、湿、外邪侵袭肌表、经络，气血运行不畅导致的，以肌肉、关节、筋骨发生肿胀、酸痛、麻木、活动障碍为主要临床症状。因痹证是由于感受风、寒、湿、热所致，故祛风、散寒、除湿、清热以及疏通经络为其基本治疗原则。久病可使气血耗伤，而表现为不同程度的气血亏虚证候，故痹证后期应适当配伍补益药。痹证相当于西医学中部分风湿性疾病(rheumaticdisease)，泛指影响骨、关节及其周围软组织，如肌腱、滑膜、筋膜等受损的一组疾病。其病因不完全清楚，有的是感染性的；有的是免疫性的，如类风湿性关节炎；有的属代谢异常，如痛风病；有的属退化性的，如骨关节炎；有的是地理环境性的，如大骨节病、氟骨症等。以感染引起的自家免疫性疾病为多见，以关节炎症、疼痛和免疫功能异常为主要临床表现。晚期可引起关节强直、畸形和功能障碍。本文以类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，RA)为痹证代表重点进行叙述。 RA系中医痹证，外因多与风寒湿三气杂致有关，如<黄帝内经)云：“风寒湿三气杂致合而为痹也”，内因多与肝肾虚弱，正气不足有关。西医学认为RA主要病理变化是关节滑膜，其次为浆膜、心、血管、神经等结缔组织广泛发生的免疫性炎症。RA是全身性自身免疫性疾病，应称类风湿病，因本病毕竟主要是以关节滑膜为靶器官的自身免疫性疾病，故沿袭国际上的习惯称为类风湿性关节炎。 RA的病因学与发病机制的研究，已深入到免疫病理、分子生物学水平。一般来说，RA的发病与病原微生物(细菌、病毒、支原体及衣原体)感染及其抗原密切相关，但迄今尚未明确地从病人血与滑膜液中找到活的病原微生物，多数学者认为病原微生物在RA发病中起始动作用。病原微生物在某些诱因(风寒、潮湿、外伤等)作用下，侵人人体MHC(HLA—DR和HLA—B27)易感基因后，抗原递呈细胞(antigen-presentingcell，APC)将抗原递呈给T细胞，T细胞在抗原的刺激下基因突变，而导致“自我耐受”崩溃，免疫调节平衡破坏，产生自身抗体和致敏淋巴细胞，而启动针对滑膜的自主免疫反应。在趋化因子和粘附因子作用下，大量炎症细胞聚集和滞留在滑膜内，产生和分泌大量类风湿因子(rheumatoidfactor，RF)、免疫复合物(immunecomplex，IC)、细胞因子和炎症介质，激活补体，介导免疫性炎症，大量骨关节滑膜细胞增殖增厚，炎症细胞浸润及血管翳形成，软骨破坏和骨侵蚀，最后引起关节畸形导致废用。RA发病机制主要由细胞免疫和体液免疫协同作用中占主导地位，自身免疫学说能够解释RA的发生和发展。参与RA免疫炎症的主要细胞成分有：T细胞、B细胞、巨噬细胞和滑膜细胞；主要细胞因子：IL—1、TNF—a、IL—6、NO等；黏附分子：E—选择素、ICAM—1及VCAM—1等；金属蛋白酶[基质金属蛋白酶(matrixmetalle-pmteinases)，MMPS]。 抗RA药物的现状：像其他自身免疫性疾病一样，目前尚无特效药，现有药物根据作用特点，主要采用免疫疗法、抗炎镇痛药等治疗。中医中药则根据辨证分型不同，分别以祛风化湿、温经散寒或清热通络等法治疗。目前研制动向是朝免疫调节剂方向发展，RA发病机制研究证明是免疫调节失衡而引起自身免疫性疾病，如T辅助细胞1／T辅助细胞2(THelpl／THelpz，THl／TH2)不平衡，是THl免疫反应疾病；另外，促炎因子和抗炎因子不平衡，IL—1、肿瘤坏死因子(TNF—a)、IL—6是促炎因子，IL—10是抗炎主要细胞因子，有人建议用IL—10治疗RA。随着对RA发病机制认识深入，研制出特异性免疫调节剂调节免疫平衡，终止免疫病理发展达到治疗作用完全是可能的。中医中药强调调节平衡，在中医理论指导下，发掘出有效免疫调节剂是值得深入研究的。 二、药效学研究的实验设计(一)特异性病理模型——免疫性关节炎动物模型1．常用动物模型(1)胶原关节炎模型：由Ⅱ型胶原(collagen．Ⅱ，CⅡ)诱导，CⅡ是软骨的主要成分，为关节炎发病学的自身抗原。该模型更贴近人RA发病机制。是近年来发展起来的重要模型，应考虑为首选模型。(2)佐剂性关节炎模型(adiuvantarthritis，AA)：将弗氏完全佐剂(Frend’scompletead-juvant，FCA)注人大鼠足跖或踝关节皮内，引起全身多处关节肿胀。其机制是结核杆菌致关节炎抗原为65kD热休克蛋白(HSP)，RA病人软骨内具有与65kDHSP相似的蛋白多糖桥联蛋白抗原成分，FCA注入后激活T细胞，激活T细胞参与RA发病机制。该模型操作简便、价廉、多用。(3)其他还有IL-1、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)诱导关节炎模荆，抗原诱发关节炎模型，大鼠被动转移性关节炎模型，家兔卵蛋白性关节炎模型等，各有特点。可根据具体需要采用。 2．主要药效指标(1)观察药物对原发病变的影响：主要观察致炎后18h及不同间隔时间佐剂注射侧足爪肿胀度。(2)观察药物对继发性病变的预防作用，在注入佐剂10日以后观察佐剂注射对侧足爪及前肢足爪肿胀度，比较给药组和对照组肿胀度的差异，并计算肿胀抑制百分率。(3)病理组织学检查：取炎性踝关节进行病理学检查，观察关节滑膜炎症、血管翳形成、软骨及骨的破坏情况。(4)免疫调节作用：因为咳病是自身免疫性疾病，细胞免疫和体液免疫协同引起免疫性炎症，细胞因子及炎症因子等导致关节病理改变，所以治疗痹证药物作相关的免疫指标：细胞免疫有T细胞对ConA增殖反应、T细胞亚型、cⅡ迟发超敏反应(DTH)等；体液免疫有B细胞对LPS增殖反应、抗cⅡ抗体测定(酶标)；巨噬细胞功能；细胞炎症因子(IL-1、TNF—a、IL-6等)的测定。每一类中选掸1—2项即可。 (二)其他痹证模型1．痛风性关节炎模型将微晶形尿酸钠注射与大鼠关节皮下或家免关节腔内，引起关节局部发生炎性肿胀，粒细胞增加，骨膜细胞肿胀，炎性细胞浸润、变形。此模型可用来评价抗痛风药物的主要疗效。2．氟骨症模型地方性氟中毒病，属中医痹证范畴，是常见地方病，在世界五大洲的50多个国家和地区都在流行，患者达2亿人。该病主要引起骨关节、牙齿损伤．同时伴有血清钙、血清磷、蛋白质、羟辅氨酸、骨胶原代谢异常。给大鼠或家兔偏食且饮料中放2xlo-4氟化钠经口染毒9星期，可造成大鼠骨软化型氟骨症模型，使骨氟，血氟和尿氟明显增加，月和牙齿受到明显损伤。用于筛选治疗地方性氟中毒的新药。 (三)其他试验1．非特异性抗炎症试验风湿痹证除了特异性免疫性炎症外，亦伴有非特异性炎症。本模型常采用各种致炎剂，如速效致炎剂有新鲜蛋清、右旋糖酊、组织胺、5—羟色胺，皮下注射后30min—1h可达到致炎高峰；中效致炎剂，常用者有角叉菜胶、酵母液，踝关节皮下注射后4--6h可达到肿胀高峰；长效毁炎剂，有甲醛和氮芥，局部注射后24h肿胀可达到高峰，持续5-7日。常用者为角叉菜胶和甲醛型，其方法简便，致炎作用可靠，前者适于预防给药，后者适于治疗给药。2．镇痛试验风湿痹证常伴有剧烈疼痛症状。常用镇痛方法有：小鼠热板法、小鼠或大鼠醋酸扭体法、大鼠或小鼠甩尾法、家兔甩头法。上述方法可适当作1-2种，观察新药的镇痛作用。 3．抗炎性渗出常用低浓度醋酸作致炎因子给小鼠腹腔注射，引起急性炎症反应，静脉注入染料伊文思蓝，测定腹腔液染料的通透量。4．增生性炎症模型本病后期常有关节局部增生性改变，引起关节畸形、功能受损，因此抑制炎症增生的药物。可使上述症状得以缓解。故采用无菌棉球、滤纸片、塑料环、琼脂或巴豆油，埋人或注人大鼠腹骨沟皮下造成慢性炎症模型，观察药物对肉芽重量的影响，也是本类新药药效研究中必做的试验。 (四)阳性对照药中药可选用相应的祛风胜湿药，如：尪痹冲剂、风湿痹康胶囊、豨桐丸、独活寄生汤(丸)、雷公藤制剂及其他药典记载的或新药审批通过的具有可靠疗效的中成药均可作为阳性对照药。也可选用适当的化学药物。口服抗炎药可选用阿司匹林、吲哚美辛(消炎痛)、布洛芬、泼尼松；注射用药可选用氢化可的松、地塞米松。镇痛试验可选用延胡索乙素、盐酸吗啡等。免疫抑制剂可选用雷公藤制剂、泼尼松、氢化可的松类，还可选用环磷酰胺、硫唑嘌呤等作为阳性对照药。