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1、测序技术的应用影响分析DNA测序技术是分了生物学研究中最常用的技术，以应用DNA双脱氧链终止法的Sange『测序为代表的第一代测序技术，在分子生物学研究领域发挥过重耍的作用［1］,如人类基因组计划(Humangenomeproject,HGP)的完成就是基于第一代测序技术［2］。目前，应用该技术的美国应用生物系统公司(App1iedBiosystems,ABD3730系列全自动测序仪仍然被广泛使用。伴随着基因组和示基因组时代的来临，第一代测序仪已经不能满足深度测序和重复测序等人规模核酸测序的需求，这就促使白2005
2、年以来诞生了以Roche/454GenomeSe—quencerFLXSystem>I1lumina/SolexaGenomcAna1yzcrIIx和ABISOLIDSystcm等测序平台为标志的新一代测序技术。新一•代测序技术乂称为深度测序技术，其最主要的特征是高通量测序，测序时间和成木都显著降低［3］。木文对新一代测序技术的基木情况、主要应用以及对作物分子育种的影响等三个方面进行重点阐述。1新一代测序技术的基木情况基于不同创新方法的各种新一代测序平台，丿&管从模板文库构建、片段扩增到测序等过程所采用的技术少生物
3、化学相当多样，但是共同点是均采用了大规模矩阵结构的微阵列分析技术，具测序的核心思想是边合成边测序(SequencingbysynLhesis,SBS）或者边连接边测序（Sequencingby1igation,SEL)。首先将片段化的DNA双链两侧连上接头，随后变性得到的单链固定在固体表面,运用微乳滴PCR(EmulsionPCR,cmPCR)、桥式PCR等不同方法产生儿百万个克隆阵列，然后利用聚合陆或连接陆进行延伸反应。生成DNA互补链时，加入的dNTP通过酶促级联反应催化底物激发岀荧光,或者肓接加入被荧光标记的
4、dNTP或半简并引物，在合成或连接生成互补链吋，释放出荧光信号。通过成像检测系统捕获光信号并转化为一个测序峰值，获得互补链序列信息。由于所有的克隆都在同一平面上，这些反应就能够大规模平行进行，每个延伸反应所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行。DNA序列延伸和成像检测不断循环，最后经过计算机分析就町以获得待测DNA片段的序列信息。1.1Roche/454测序平台454生命科学公司是新一代测序技术的奠基者，最早推出了划时代的新型高通量基因组测序系统GcnomcScqucncer20System,这一技术的建立开创了边
5、合成边测序(Sequencingbysynthe—sis,SBS)的先河，利用微乳滴PCR实现DNA片段的扩增,光学信号的产生棊于焦磷酸测序法［4—5］。Z后，454公司被罗氏诊断公司(RocheInc.)收购，测序仪经过改造升级，相继推岀GSFLXSystem和GSFLX+System。为适合规模较小的实验室，Roche/454还推出初级版的新一代测序仪GSJun—iorSystem。冃前，授新的Roche454GSFLX+System最长读长能达到1kb,平均读长700bp。和对其他公司开发的新一代测序仪，Ro
6、che/454测序仪的突出优势是较长的测序读长，但是测序价格比较昂贵。对于那些要求较长读长的应用，如复杂基因纽的从头测序项目，Roche/454测序仪是故理想的选择。1.2I1lumina/Solcxa测序平台I11umina公司的新一代测序仪最早由So1exa公司研发，基于边合成边测序(Sequencingbysyn—thesis,SBS)的思想，利用其专利核心技术“DNA簇”和“可逆性末端终结(Reversibleterminator)实现自动化样本制备和大规模平行测序，具文库片段的扩增是通过桥式PCR來实现［
7、5］。Illumina公司收购ISo1cxa,目前推出多种型号，满足各种需求的测序仪，按测序产量的多少排序为HiSeq2000(600Gb).HiSeq1000(300Gb).HiScanSQ(150Gb)>GenomeAna1yzerIlx(95Gb)>MiSeq(>1Gb)0数据产量最大的HiSeq2000测序系统的末端配对读长可达到2x100bp,虽然在读长上比Roche/454测序仪短，但是由于运行成本低廉，数据读取量大，Illumina/Solcxa测序仪是性价比较高的新一代测序平台，已经得到广泛应用。1
8、.3ABISOLID测序平台美国应用生物系统公司(AppliedBiosyslems,ABI)的3730系列全白动测序仪在第一•代测序方面一直占据着重要地位。新一代测序技术出现以后，ABI公司推出SOLiD新一代测序平台，并不断进行改进，如今升级到S0LiD5500x1System。与Roche/454测序仪相似，ABISOLID测序平台也是通过微乳滴PCR
