项目一(五)：常用生物化学实验技术及原理

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1、生物化学实用技术主讲老师：刘名江生物与生态工程学院（一）生物大分子的制备和保存技术——蛋白质、核酸的分离和提纯研究生物大分子，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。基本原理不外乎两方面：一是利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离的目的，如电泳、超速离心、超滤等。而在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、碱、高温及剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。生物大分子的制备一般分

2、为以下四个阶段：①选择材料和预处理；②细胞的破碎及细胞器的分离；③提取和纯化；④浓缩干燥和保存(冷冻干燥)。（二）色谱分离技术色谱分离技术，又称层析分离技术或色层分离技术，是一种分离复杂混合物中各个组分的有效方法。它是利用混合物中各组分的理化性质（溶解度、吸附力、分子极性、分子形状和大小等）的不同，使各组分以不同程度在两个相中，其中一个相是固定的。不同物质在由固定相和流动相构成的体系中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质随流动相一起运动，并在两相间进行反复多次的分配，从而使各物质达到分离色谱分析法的由来1906年，俄国植物学家Tsweet将CaC

3、O3固体粉末装入竖立的玻璃管中，从顶端倒入植物色素的石油醚浸出液，并用石油醚连续地冲洗。结果在柱中出现了颜色不同的色带。因此，Tsweet把这种方法称为色谱法。如今，色谱法不仅用于有色物质的分离，而且大量用于无色物质的分离。所以色谱法已经失去原来的含义。但是，现在仍沿用色谱法这个名称。色谱法具有分离及分析两种功能。它是分析混合物最有力的手段。色谱分离是目前应用最广泛的分离方法。已广泛地用于石油化工、有机合成、生理生化、医药卫生、环境监测、刑事侦查、生产在线控制，乃至空间探索等许多领域，以解决各种分离分析课题。工业色谱分离技术原理色谱分离技术是基于不同物质在由

4、固定相和流动相构成的体系中具有不同的分配系数，在采用流动相洗脱过程中呈现不同保留时间，从而实现分离。传统色谱分离技术采用固定的色谱塔进行，先进入一定量物料，然后采用洗脱剂不断洗脱，在同一出口在不同时间段就可接到不同的产品组分，此过程费时费力。经过分析并加以改进，我们把固定相的树脂做成可以连续流动的系统，利用物质与固定相的相对运动速度不同实现分离。类似龟兔赛跑的原理，我们把固定相必成一个传送带，把兔子乌龟分别必成快慢不同的两组份，只要使固定相加上一个与洗脱方向相反的驱动力，使传送带运动速度处于兔子和乌龟速度中间，跑的快的兔子比固定相快从前头得到，跑得慢的乌龟被

5、传送带带到后面得到。凝胶色谱分离技术原理2、色谱法的特点（1）分离效率高：可在很短的时间内分离多达二、三百个组分的复杂物质，柱效能可达106的理论板。（2）检测能力强：可以检测出10-11~10-15克级的痕量组分，能满足环境检测、农药残留等大量日常检测分析的需要。（3）样品用量少：样品用量一般为微升级，少的可达纳克级。（4）适用范围广：几乎所有与化学有关的领域都有其用武之地。3、色谱分类流动相与固定相聚集态（1）按两相所处的物态分类（2）按分离机理分类利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法，称为吸附色谱法。利用组分在固定液（固定相）

6、中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法。利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法。利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法，称为凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法。最近，又有一种新分离技术，利用不同组分与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行分离的技术称为亲和色谱法，常用于蛋白质的分离。（3）按固定相的外型分类固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱。固定相呈平板状的色谱，称为平板色谱，它又可分为薄层色谱和纸色谱。（4）按照展开程序分类按照展开程序的不同，可将色谱法分为洗脱法、顶替法、和迎头法。洗脱法也称

7、冲洗法。工作时，首先将样品加到色谱柱头上，然后用吸附或溶解能力比试样组分弱得多的气体或液体作冲洗剂。由于各组分在固定相上的吸附或溶解能力不同，被冲洗剂带出的先后次序也不同，从而使组分彼此分离。流出曲线下图AB这种方法能使样品的各组分获得良好的分离，色谱峰清晰。此外，除去冲洗剂后，可获得纯度较高的物质。目前，这种方法是色谱法中最常用的一种方法。顶替法是将样品加到色谱柱头后，在惰性流动相中加入对固定相的吸附或溶解能力比所有试样组分强的物质为顶替剂（或直接用顶替剂作流动相），通过色谱柱，将各组分按吸附或溶解能力的强弱顺序，依次顶替出固定相。很明显，吸附或溶解能力最

8、弱的组分最先流出，最强的最后流出。顶替法的流出曲线如