PCR相关问题分析

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1、关于PCR的一些问题：1.简介寡聚核背酸引物的选择，通常是整个扩增反应成功的关键。所选的引物序列将决定PCR产物的大小、位置、以及扩增区域的Tm值这个和扩增物产量有关的重要物理参数。好的引物设计可以避免背景和非特异产物的产生，其至在RNA-PCR屮也能识别cDNA或基因纟R模板。引物设计也极大的影响扩增产量：若使用设计粗糙的引物，产物将很少其至没有；而使用正确设计的引物得到的产物屋可接近于反应指数期的产量理论值。当然，即使有了好的引物,依然需要进行反应条件的优化，比如调整Mg2+浓度，使用特殊的共溶剂如二甲基亚飒、甲酰胺和甘汕。计算机辅助引物设计比人工设计或随机选

2、取更有效。一些影响PCR反应屮引物作用的因素诸如溶解温度、引物间可能的同源性等，易于在计算机软件中被编码和限定。计算机的高速度可完成对引物位置、长度以及适应用户特殊条件的其他有关引物的变换可能性的大量计算。通过对成T种组合的检测，调整各项参数，可提出适合用户特殊实验的引物。因此通过计算机软件选择的引物的总体“质量”（由用户在程序参数屮设定）保证优于通过人工导出的引物。需要指出的是，引物不必与模板完全同源，因此可包含启动子序列、限制酶识别位点或5,端的各种修饰，这种对引物的修饰不会妨碍PCR反应，而会在以后使用扩增子时发挥作用。2.基本PCR引物设计参数引物设计的目

3、的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。特异性是指发生错谋引发的频率。特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的PCR扩增了，在EB染色的琼脂糖凝胶上可见到：引物效率是指在每一PCR循环中一对引物扩增的产物与理论上成借增长量的接近程度。①引物长度；特异性一般通过引物长度和退火温度控制。如果PCR的退火温度设置在近于引物Tm值（引物/模板双链体的解链温度）几度的范围内，18到24个碱基的寡核昔酸链是有很好的序列特异性的。引物越长，扩增退火时被引发的模板越少。为优化PCR反应，使用确保溶解温度不低于54°C的最短的引物，可获得最好的效率和特异性。总的来说，

4、最好在特异性允许的范围内寻求安全性。每增加一个核甘酸，引物特异性提高4倍;这样，人多数应用的最矩引物氏度为18个核苜酸。引物设计时使合成的寡核昔酸链（18〜24聚物）适用于多种实验条件仍不失为明智Z举。②引物的二级结构包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。这些因素会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。对于引物的3,末端形成的二聚体，应控制其AG大于-5.0kcal/mol或少于三个连续的碱基互补，因为此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定结构的可能性，引物屮间或8端的要求可适当放宽。引物自身形成的发卡结构，也以3,端或近3,端对•引物■模板结合影响更大；

5、彫响发R结构的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能Z外，与茎环结构形式亦有很人的关系。应尽蜃避免3、末端有发卡结构的引物。③引物GC含量和Tm值PCR引物应该保持合理的GC含量。含有50%的3C的20个碱基的寡核芹酸链的Tm值人概在56〜62°C范围内，这可为有效退火提供足够热度。一对引物的GC含量和Tm值应该协调。协调性差的引物对的效率和特异性都较差，因为降低rTm值导致特异性的丧失。这种情况下引物Tm值越高，其错谋引发的机率也越人。若采用太高的退火温度，Tm值低的引物对可能完全不发挥作用。在从一•批在特定序列范围内已合成好的寡核背酸中选择一对新的引物时，这种GC

6、含量和Tm值的协调非常关键。一般来说，一对引物的Tm值相差尽量不超过2〜3摄氏度，同时引物和产物的Tm值也不要相差太人，20摄氏度范I节I内较好。①引物的额外序列与退火温度若有额外的序列信息要加到引物中，例如T7RNA聚合酚结合位点、限制酶切位点或者GC发夹结构可以使用加长的引物。一•般说來，引物5,端添加无关序列不会影响引物特异序列的退火。有时候，引物屮添加了人量与模板不配对的碱基，可以在较低退火温度的条件下进行4到5个扩增循环；然后在假定引物5,端序列已经加入到模板中，计算得出的退火温度下进行其余的循环。在引物匕添加限制酶位点时一个重要的考虑是大多数限制酚的冇

7、效切割要求在它们的识别序列的&端有2至3个非特异的额外碱基，这样就会增加引物的非模板特异序列的长度。长引物序列的另一个缺点是影响溶解温度的精确计算，而这对于确定PCR反应吋的退火温度又是必须的。对于低于20个碱基的引物，Tm值可以根据Tm=4(G+C)+2(A+T)计算。而对于较长的引物，Tm值需要考虑动力学参数、从“最近邻位”的计算方式得到，现有的PCR引物设计软件大多数都采用这种方式。②引物的宙末端核昔酸组成引物3,末端和模板的碱基完全配对对于获得好的结果是非常重要的，而引物3,末端最后5到6个核昔酸的错配应尽可能的少。如果3,末端的错配过多，通过降低反应的退

8、火温度来补