PCR常见问题分析.doc

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1、PCR常见问题分析◊假阳性现象：阴性样品出现的PCR扩增条带与H的靶序列条带一致常见问题可能原因建议解决方案PCR污染靶序列或扩增产物的交叉污染操作时应小心轻柔，防止将含靶序列的样品吸入加样枪内或溅出高心管外；试剂或器材应高压灭菌，破坏存在的核酸。试剂污染各种试剂先进行分装，并低温贮存。引物引物设计不合适，选择的扩增序列与非bl的扩增序列有同源性重新设计引物。◊出现非特异性扩增现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者有时同时出现特异性扩增带与非特异性扩增常见问题可能原因建议解决方案引物引物特异性差重新设计引物。引物浓度过高适当减少引物浓度。Mg?+浓度

2、Mg?+浓度过高适当降低Mg?*浓度,从1mM到3mM,间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物最佳镁离了浓度.耐热聚合酶酶量过多以0.5U为间隔适当减少酶量.退火温度退火温度过低适当提高退火温度或采用二阶段温度法.PCR循环次数PCR循环次数过多减少FCR循环次数.◊扩增无带常见问题可能原因建议解决方案引物引物设计不合适或降解重新设计引物模板模板降解重新制备模板Mg"浓度Mg2+浓度过低适当降低Mg2+浓度,从ImM到3mM,间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物最佳镁离子浓度.退火温度退火温度过高适当降低退火温度延伸时间延伸时间短增加延伸时间◊

3、出现片状拖带或涂抹带常见问题可能原因建议解决方案引物特异性差重新设计引物，改变引物的位置和长度，增强基特异性.模板DNA模板不纯纯化模板或使用试剂盒提取DNA.耐热聚合酶酶量过多以0.5U为间隔适当减少酶量.Mg?*浓度Mg?*浓度过高适当降低Mg"浓度,从IniM到3mM,间隔0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最佳镁离了浓度.dNTPdNTP浓度过高适当降低dNTP浓度.退火温度退火温度过低适当提高退火温度