PCR常见问题分析及对策「精编推荐]

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1、PCR常见问题分析及对策PCR常见问题分析及对策（无扩增产物、非特异性扩增、拖島假阳性）问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3•引物设计不当或者发生降解4•反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策.1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3•重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间M样品样品正对照问题2：非特异性扩增M123现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩壇带原因：1・引物特异性差2•模板或引

2、物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3•适当捉高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现彖：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物

3、的交*污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。3•各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR引物设计的黄金法则(转自tiangen)1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件(比如DNAman)比对(Alignment),各基因相同的序列就是该基因的保守区2.引物氏度一般在15飞0碱基之间。引物长度(primerlength)常用的是18-2

4、7bp,但不应大于38,因为过长会导致具延伸温度大于74°C,不适于TeiqDNA聚合酶进行反应。3•引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72°C。GC含量(composition)过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值(meltingtemperature)是寡核昔酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核昔酸双链解链的温度。冇效启动温度，一般高于Tm值5~10°C。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值，则冇效引物的Tm为55飞0°C，其Tm值最好接近72°C以使复性条件最佳。4.引物

5、3,端要避开密码子的第3位。如扩壇编码区域，引物3’端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。5•引物3’端不能选择A,最好选择T。引物:T端错配吋，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A吋,即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、TZ间，所以3,端最好选择T。6.碱基要随机分布。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3,端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发(Falsepriming)o降低引物与模板相似性的一•种方法是，引物中四种碱基的分布

6、最好是随机的，不要有聚嚓吟或聚唸唳的存在。尤其3,端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构(Hairpin)使引物木身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物口身不能有连续4个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免:T端的互补重叠以防止引物二聚体(Dimer与Crossdimer)的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其AG值不要过高（应小于4.5kcal/mol）o

7、否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物冇效浓度而使PCR反应不能正常进行。&引物产端和中间AG值应该相对较高，而：V端AG值较低。AG值是指DNA双链形成所需的0由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，AG值越大，则双链越稳定。应当选用夕端和屮间AG值相对较高，而37端AG值较低（绝对值不超过9）的引物。引物：T端的AG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。（不同位置的AG值可以用Oligo6软件进行分析）9•引物的5,端可以修饰，而3,端不可修饰。引物的5，端决定着PCR产物的氏度，它对扩增特异性影响不大。因此