资源描述：
《【精品】PCR常见问题分析及对策》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、PCR常见问题分析及对策（无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性）问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因：1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3•引物设计不当或者发生降解4•反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策：1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4•降低退火温度、延长延伸时间M样品样品正对照问题2：非特异性扩增MTN3现象：条带与预计的大小不一致或
2、者非特异性扩增带原因：1•引物特异性差2•模板或引物浓度过高3•酶量过多1.Mg2+浓度偏髙5•退火温度偏低6•循环次数过多对策：1•重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4•降低镁离了浓度5•适当提高退火温度或使用二阶段温度法6•减少循环次数问题3：拖尾M12现象:产物在凝胶上呈Smear状态。原因：1•模板不纯2.Buffer不合适3•退火温度偏低4•酶量过多1.dNTP、Mg2+浓度偏高6•循环次数过多对策：1•纯化模板2.更换Buffer3•适当提高退火温度
3、2.适量用酶5•适当降低dNTP和镁离子的浓度6•减少循环次数问题4：假阳性现象：空口对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2•除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。3•各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR引物设计的黄金法则(转自tiangen)1•引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物
4、种的同一基因，通过序列分析软件(比如DNAman)比对(Alignment),各基因相同的序列就是该基因的保守区2•引物长度一般在15〜30碱基之间。引物长度(primerlength)常用的是18-27bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大T74°C,环适丁-TaqDNA聚合酶进行反应。3•引物GC含量在40%〜60%之间，Tm值最好接近72°C。GC含量(composition)过高或过低都不利于引发反.应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值(meltingte
5、mperature)是寡核莒酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核营酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10°C。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80°C,其Tm值最好接近72°C以使复性条件最佳。4•引物3,端要避开密码了的第3位。如扩增编码区域，引物3,端不要终止于密码了的第3位，因密码子的第3位易发牛简并，会影响扩增的特异性与效率。5•引物3,端不能选择A,最好选择T。引物3,端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当
6、末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3,端最好选择T。1.碱基要随机分布。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3,端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。卩紙引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嚓吟或聚卩密睫的存在。尤其3,端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。2.引物自身及引物之间不应存在互补序
7、列。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3,端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Crossdimer）的形成。弓［物之间不能有连续4个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其AG值不要过高（应小于4.5kcal/mol）o否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。1.
8、引物亍端和中间AG值应该相对较高，而引端AG值较低。△G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，AG值越大，则双链越稳定。应当选用亍端和中间AG值相对较高，而3,端AG值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3,端的AG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。（不同位置的AG值可以用Oligo6软件进行分析）9•引物的亍端可以修饰，而3,端不可修饰。引物的亍端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰
