实验二 、培养基及胰酶的配制

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1、实验二、培养基及胰酶的配制一、实验原理：（一）细胞培养的气体环境与pH环境(二）细胞培养的营养条件1.培养用液培养液（基）、缓冲液、平衡盐溶液、血清及消化液、pH调节液和抗生素等。血清的主要成分及含量培养基的主要种类（基础培养基）(1)MEM(低限量基础培养基，minimumeessentialmedia):(2)DMEM(Dulbecco’smodifiedEaglemedium)(3)IMDM(Iscove’smodifiedDulbecco’smedium)(4)RPMI1640(5)HamF10、HamF1

2、2(6)McCoy’s5A消化液0.1-0.25%胰酶0.02%EDTApH=8.0二、实验目的1.掌握DMEM培养基、胰酶的配制2.学习针头滤器的使用方法三、实验步骤(一）DMEM培养基的配制1.三袋DMEM粉末用双蒸水溶解（先加入2/3DDW，再用DDW冲洗袋子）、磁力搅拌器搅拌半小时以上。2.加入1.2g/袋NaHCO3定容3000mL、搅拌30分钟。每人在超净台内用大滤器过滤、分装、写好种类、名字。（留取少许做污染测试放CO2培养箱72小时）3.每8个人为一组，每人过滤90mL，其余的过滤到100mL试剂瓶

3、中，每瓶90mL培养基备用。使用前在超净台内加入56℃灭活好的FCS10mL，使血清的终浓度为10%，4℃保存待用。（二）胰酶的配制1.取实验一中准备好的D–Hanks液200mL（8人一组）2.称取0.5g胰酶（0.25%）放入研磨器中并加入少量D–Hanks液成为糊状，研磨200次，再加入D–Hanks液终体积为200ml，合并胰酶，加0.02%EDTA助消化，磁力搅拌使之完全溶解。（8人一组，分别研磨，再合并）3.用NaHCO3调pH至8.0。4.小滤器（实验一中已湿热灭菌过的）过滤除菌至小瓶内,(不能装的过

4、满,防止冷冻后瓶爆裂)、检查滤器、贴好标签、-20℃保存。每人过滤20mL。（注意：1.拧紧滤器2.注射器吸液体3.注射器插好滤器4.对着烧杯慢推压针芯看是否漏5.如不漏对小瓶过滤。6.滤器放在小瓶瓶口上，取下针头再吸液体，反复多次，滤完。7.检查滤器滤膜是否完好。）四、思考题1.细胞培养中为什么添加血清？2.使用血清需注意哪些方面？3.消化液胰酶的浓度是多少？4.使用小滤器过滤要注意哪些？