免疫标记技术

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1、免疫标记技术主要内容免疫荧光技术放射免疫分析法酶免疫分析法免疫印迹法用标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应用荧光素、放射性核素或酶标记的抗体或抗原是目前广泛应用的敏感可靠的方法。上述三种常用的标记物与抗原或抗体化学连接之后不改变后者的免疫特性。本方法可用于定性、定量或定位检测。免疫荧光技术（Immunofluorescencetechnique）又称荧光抗体技术，是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。此技术是用不影响抗原抗体活性的荧光色素标记抗体（或抗原），再与组织或细胞中的相

2、应的抗原（或抗体）结合后，通过荧光反应检测抗原抗体的一种技术。三种方法直接染色法：将标记的特异荧光抗体直接加在抗原标本上，经一定温度和时间染色，洗去未参加反应的多余荧光抗体，在荧光显微镜下见到被检抗原与荧光抗体形成的特异性结合物而发出的荧光。直接免疫荧光可用于病毒感染细胞、带某种特异抗原的细胞（如T细胞和B细胞）或病原体的检查；也可用于组织者沉着的免疫复合物检查。优点是特异性高，操作简便，比较快速缺点是检查多种抗原，需分别制备相应的多种标记抗体。间接染色法：如果检查组织或细胞上的未知抗原，可将抗

3、原直接与相应抗体（不标记荧光）结合，此为第一抗体，作用一定时间后，洗去未反应的抗体，再把能与第一抗体特异结合有荧光标记的抗抗体即免疫球蛋白抗体（第二抗体）加入，如果第一步中的抗原抗体互相发生了反应，则抗体被固定，并与第二步加入的荧光素标记的抗抗体结合，形成抗原-抗体-抗抗体复合物，再洗去未反应的标记抗抗体，在荧光显微镜下可见荧光。间接免疫荧光间接染色法克服直接法需制备多种荧光素标记抗体的复杂操作，用一种标记的抗球蛋白抗体就能与种属相同的所有动物的抗体结合，检查各种未知抗原或抗体，且敏感性高。缺点

4、是，由于参加反应的因素较多，受干扰的可能性也较大，判断结果有时较难，对照较多，时间长。抗补体染色法：简称补体法，是间接染色法的一种改良法。利用补体结合反应的原理，用荧光素标记抗补体抗体，鉴定未知抗原或未知抗体（待检血清）。染色程序分为两步：先将未标记的抗体和补体加在抗原标本上，使其发生反应，水洗，再加标记的抗补体抗体。如果第一步中抗原抗体发生反应，形成复合物，则补体被抗原抗体复合物结合。第二步加入的荧光素标记的抗补体抗体便与补体发生特异性反应，使之形成抗原-抗体-补体-抗补体抗体复合物，发出荧光

5、。该法优点与间接法相同，且只需一种标记抗补体抗体，便能检测各种抗原-抗体系统。因为补体的作用没有特异性，可与任何哺乳动物的抗原-抗体系统发生反应。缺点是参与反应的成分多，染色程序较复杂，操作较麻烦。技术特点免疫荧光技术将抗原和抗体的特异性与形态学检查结合，能实现快速、敏感、定位。但不能观察组织细胞的细微结构，标本不能永久保存，荧光有自然消退现象，需及时观察及时照相；在实验中容易有非特异性荧光干扰。放射免疫分析法（radioimmunoassay，RIA）放射免疫分析法应用竞争性结合原理，用放射性

6、核素标记抗原（或抗体）与相应抗体（或抗原）结合，通过测定抗原抗体结合物的放射性活性判断结果。可进行超微量分析，敏感性高，特异性强，准确性好，可用于测定抗原、抗体、抗原抗体复合物。两种方法液相法：将待检标本（含胰岛素抗原）与定量放射性核素标记的胰岛素（抗原）和定量抗胰岛素抗体混合，经一定时间作用后，分离收集抗原抗体复合物及游离抗原，分别测定这两部分的放射性活性，计算结合率。在反应系统中，待检标本的胰岛素抗原与放射性核素标记的胰岛素竞争性结合。非标记抗原越多，标记抗原与抗体形成的复合物越少。非标记抗

7、原含量与标记抗原抗体复合物的量成一定函数关系。预先用标准的非标记抗原作成标准曲线后，即可查出待检标本中胰岛素的含量。固相法：将抗原或抗体吸附到固相载体表面，然后加待检标本，最后加标记抗体，测定固相载体的放射性活性。放射免疫分析法应用范围广泛，可用于包括多种激素（胰岛素、生长激素、甲状腺素等）、维生素、药物、IgE等。但由于有放射性污染，近年有逐渐被非放射性免疫分析法取代的趋势。酶免疫分析法（enzymeimmunoassay，EIA）酶免疫分析法是将抗原抗体反应的特异性与酶对底物的高效催化作用结

8、合，使酶作用于底物后显色，以颜色变化来判断试验结果。应用酶标测定仪可作定量分析、敏感度可达ng水平。常用于标记的酶有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。这些酶具有一定的稳定性，制成酶标抗体可保存较长时间。目前常用的方法有酶标免疫组化法和酶联免疫吸附法。前者测定细胞表面抗原或组织内的抗原，后者主要测定可溶性抗原与抗体。本法既无放射性污染又不需昂贵的测试仪器，且试剂稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观，既可定性也可定量分析等，已广泛用于免疫学、微生物学、寄生虫学、肿瘤学和细胞因子检测等领域。酶联免疫吸附