实验室常用技术

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1、生物分子类实验室常用实验技术原理汇一、GSTpull-down实验基木原理:将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱W肽亲和树脂上，作为与冃的蛋白亲和的支撑物，充当一种“诱饵蛋口”，目的蛋白溶液过柱，可从屮捕获与之相互作用的“捕获蛋口”(目的蛋口)，洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析，从而证实两种蛋111间的相互作用或筛选相应的目的蛋白，“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行，操作方便。注：GST即谷胱甘肽蔬基转移腮(glutathioneS-transferase)二、足印

2、法(Footprinting)足卬法(Footprinting)是一种用来测定DNA-蛋白质专一，性结合的方法，用于检测目的DNA序列与特定蛋白质的结合，也可展示蛋白质因了同特定DNA片段Z间的结合。其原理为：DNA和蛋白质结合后，DNA与蛋白的结合区域不能被DNase(脱氧核糖核酸猶)分解，在对F1的DNA序列进行检测时便出现了一段无DNA序列的空白区(即蛋白质结合区)，从而了解与蛋白质结合部位的核昔酸数n及其核莒酸序列。三、染色质免疫共沉淀技术(ChromatinImmunoprecipitation,ChIP)染色质免疫共沉淀技术(Chromat

3、inImmunoprecipitation,ChIP)是研究体内蛋口质与DA相互作用的有力工具，利用该技术不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用來研究组蛋白的各种共价修饰以及转录因了与基因表达的关系。染色质免疫沉淀技术的原理是：在牛理状态F把细胞内的DA与黃口质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段示，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白和结介的DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一燉包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化及鉴定。四、基因芯片(乂称DNA芯片、生物芯片)技术基因芯片指将人

4、量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的朵交信号强度进而获収样詁分子的数量和序列信息。通俗地说，就是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段(基因探针)，冇规律地排列固定于2ci/的硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，被称为基因芯片。基因芯片主要用于基因检测工作。基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组己知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表而固定了序列己知的八核昔酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG,与基因芯片上对应位置的核酸探针

5、产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。一组八核昔酸探针4由朶交位宣确定的一组朵交探针组重组的互补序列靶序列4基因芯片的测序原理五、高效液相色谱（HPLC）高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送；色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达儿万或儿十丿j）;同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。高压泵将贮液罐的流动相经进样器送入色谱柱中，然后从检测器的出口流出，这时整个系统就被

6、流动相充满。当欲分离样品从进样器进入时,流经进样器的流动相将其带入色谱柱屮进行分离，分离后不同组分依先后顺序进入检测器，记录仪将进入检测器的信号记录下来，得到液相色谱图。吸附色谱分旣色谱离子色谱体稹排阻色谱亲和色谱固定全多孔固体固走液载帯在固高效徴粒离子具有不同孔径的多孔多种不同性能的配位体键联相吸附割相基体上交换割性凝胶在固相基体上流动不同极性有不同极性有机溶不同PH值的有机溶剂或一定PH值不同PH值的缓冲溶液，可加相机溶割制和水缓冲溶液的缓冲溶液入改性制分离原理吸附与解吸溶解与挥发可逆性的离子交换多孔凝胶的渗逶或过具有锁匙结构络台物的可逆性离解六、

7、酵母双杂交（Y2H）酵母双杂交系统的建立詳母双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识°80年代的工作表明，转录激活因子在结构上是组件式的，即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中有DNA结合结构域（DNAbindingdomain简称为BD）和转录激活结构域(activationdomain,简称为AD）,BD可识别DNA±的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游；AD可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录°单独的BD虽然能和启动子结合，但是不能激活转录,不同转录激活因子的BD和AD形成的杂合

8、蛋白仍然具有正常的激活转录的功能（如酉寺母细胞的G日14蛋旦的BD与犬肠杆菌的一个酸性激活结构