预防兽医常用实验室技术

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1、HA和HI实验2010-5-10二、实验原理病毒的红细胞凝集现象：许多病毒表面有血凝素，能与多种动物的红细胞表面受体结合，从而出现红细胞凝集现象，简称为病毒的血凝现象。有血凝特性的病毒：AIV、NDV、狂犬病毒、犬细心病毒、鸡产蛋下降综合症病毒等。实验原理实验材料抗凝剂、PBS、96孔V型微量反应板、1%红细胞悬液、微量移液器、微量振荡器等。红细胞悬液制备病毒的红细胞凝集试验（HA）病毒的红细胞凝集抑制试验（HI）实验内容鸡红细胞悬液的制备用注射器无菌抽取健康非免疫鸡的静脉血，与抗凝剂等量混匀。加生理盐水或PBS适

2、量，洗涤离心，共离心三次：第一、二次1000rpm×10min、第三次1200rpm×10min。目的为洗去血清及白细胞，防止红细胞溶血。（红细胞洗涤过程最好在4℃进行）所余的纯红细胞，用生理盐水或PBS稀释100倍，即成1%的鸡红细胞悬液，放置于4℃备用。HA实验先将待检病毒材料稀释成不同的稀释倍数，再加入1%的鸡红细胞，混匀，4℃静置后观察结果。在出现血凝现象的各稀释孔中，能使红细胞出现完全凝集的病毒的最大稀释倍数即定为病毒的凝集价。又称为该病毒的血凝滴度。判定标准：（＋）凝集反应者，凝集的红细胞呈薄膜状，均匀

3、的铺满孔底。（－）红细胞全部沉于孔底中央，周围无散在的红细胞。孔号123…….1011对照病毒稀释倍数212223…….210211（1）生理盐水或PBS252525……..252525（2）病毒252525……..2525弃去25（3）生理盐水或PBS252525……..252525（4）1%红细胞悬液252525……..252525振荡混匀，4℃或室温温箱作用，10分钟开始观察，直到结果出现。HA的实验步骤病毒的红细胞凝集抑制试验（HI）（1）凝集抑制价的含义及判定（2）4单位病毒的配制（3）HI实验与步骤凝集

4、抑制价的含义及判定标准HI试验：病毒的红细胞凝集现象，可以被特异性免疫血清所抑制，称HI试验。抗体效价：出现红细胞凝集完全抑制现象的血清的最大稀释倍数叫抗体效价，又称该血清的HI滴度。判定标准：（+）即出现红细胞凝集被抑制者，红细胞全部沉于孔底中央，周围无散在的红细胞。（－）凝集的红细胞呈薄膜状，均匀的覆满孔底，有的似有红细胞沉积于中央。4单位病毒的配制1单位病毒将病毒按其血凝滴度进行稀释后所得的病毒液为1单位病毒。4单位病毒即将一个血凝单位的病毒增加至4倍浓度，例如一个血凝单位为1:64，4个血凝单位则为64/4

5、=16倍稀释。注意：4单位病毒配制好后，还需要进行HA实验验证，测定其血凝价是否为4，而后再进行下一步实验。孔号123…….10对照对照血清稀释倍数212223…….210（1）生理盐水或PBS252525……..252525（2）血清252525……..25弃去25（3）4单位病毒252525……..252525PBS振荡混匀，室温或37℃温箱15-30分钟（4）1%红细胞悬液252525……..252525振荡混匀，室温或4℃温箱作用，10分钟后开始观察，直到结果出现HI实验与步骤病毒的灭活灭活是指用物理或化学

6、手段杀死病毒、细菌等，但是不损害它们体内有用抗原的方法。病毒灭活会使病毒蛋白的高级结构受到破坏，蛋白不再有生理活性，所以失去感染，致病和繁殖能力，但是常规的灭活不影响病毒蛋白的一级结构，所以灭活的病毒具有抗原性，但失去感染力。病毒灭活的方法化学消毒剂法（如次氯酸钠）胃蛋白酶处理法热处理法：干热法（80℃，72h），蒸汽加热（60℃，10h），巴斯德加热处理法有机溶剂或去污剂处理法（如甲醛、吐温80）低PH孵育法紫外线照射处理法病毒灭活的确证由于制品的组成、稳定剂及其浓度的不同，均会对灭活病毒效果有一定的影响。因此在

7、灭活病毒后必须进行病毒灭活效果验证。验证方法包括：蚀斑形成、细胞病变（如合胞体或病灶形成）、终点滴定或其他方法。这些方法应该有适宜的灵敏度和可重复性，每一个取样点应取双份样品并设有对照以保证结果的准确性。流感病毒的甲醛灭活法原理：甲醛使微生物的蛋白质、核酸变性，导致微生物死亡，但不明显影响其免疫原性。步骤：将甲醛（市售一般在37％）用PBS稀释到50倍。然后稀释后的甲醛与尿囊液以7：43的比例混合（注：甲醛应缓慢滴加到病毒尿囊液中，边摇动边加入）。甲醛加入后，将尿囊液置于4℃灭活12h，每隔2h摇动一次。而后，置3

8、7℃摇床内继续灭活12h，就可以完全灭活。会使原来病毒的效价降低1~2个滴度。验证：将灭活后的病毒液接取样接种10日龄鸡胚，观察鸡胚是否死亡？是否有HA效价？