重组人血白蛋白在哺乳动物细胞培养中的应用

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1、重组人血白蛋白在哺乳动物细胞培养中的应用关键词：重组人血白蛋白；细胞培养目询，哺乳动物细胞人规模培养技术已经成为生物技术制药中不可缺少的一部分，利用动物细胞培养技术牛产的牛物制品越来越多，这些牛物制品主要包括人用疫苗、基因工程药物、基因治疗药物、抗体药物以及动物疫苗等，而组织工程和干细胞疗法拓宽了细胞培养技术的应用范围。人血•白蛋白作为动物细胞培养基中的重要组分z—,在动物细胞培养中已经应用了很多年。本文就重组人血白蛋白(RecombinantHumanserumAlbumin,rHSA)在哺乳动物细胞培养中的

2、应用情况作一综述。1人血白蛋白的结构特征人血口蛋口(HumanserumAlbumin,HSA)是人血浆中含量最丰富的蛋白质(42土3.5g/l),也是血浆蛋白质中少冇的非糖基化蛋白之一，占血浆总蛋白的40~60%,在细胞牛理活动屮起着重要的作用。其单链多肽由585个氨基酸组成,相对分子质量(Mr)约为66500oX射线晶体结构揭示了其是一个80X80X30A的心形分子，含67%a-螺旋，没冇B■折叠⑴。白蛋白结构的显著特征是有三个同源区域：I、II和III。每个结构域又分别由2个由4〜6个a・螺旋组成的亚结构

3、域A、B组成，以高度不对称的方式装配成分子(见图1)oHSA有35个半胱氨酸残基，其屮34个组成17对分子内二硫键，另有一个自由的半胱氨酸残基Cys34,从而确保了其亚结构域的刚性结构。这个Cys34在口蛋口的氧化还原反应屮起着至关重耍的作用。结构研究表明，重组人血白蛋白与血源人血白蛋白结构完全相同，替代血源人血口蛋口进行细胞培养时，其作用功能完全相同。图1人血白蛋白结构示意图2重组人血白蛋白在细胞培养中的作用人血白蛋白在细胞培养屮有多种生理功能，可概括为：重金属螯合剂；自由基清除剂；渗透压和pH值的调节剂；稳

4、定剂；生长因子的运载休；表面活性剂以及营养剂⑵。然而，目前市场上使用的人血白蛋白产品因为来源丁血液，存在潜在被病毒和航病毒污染的安全隐患。结构研究表明，重组人血口蛋口（rHSA）与血源人血白蛋白（HSA）具冇相同的氨基酸组成及结构特征，其在细胞培养方面的作用功能与血源人血白蛋白完全相同，完全可替代血源人血白蛋白用于细胞培养，缓解目前临床用药的紧张局面，而更重要的是产品的安全性更高。用重组产品替代动物源产品是将来生物技术发展的必然趋势。3重组人血白蛋白在细胞培养中的应用3.1对非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）的促生

5、长作用我公司与Vero细胞狂犬疫苗牛产企业合作进行了重组人血白蛋白替代血源人血白蛋白的验证实验。使用重组人血白蛋白（rHSA）与人血白蛋白作为培养基主要组分，用于生产Vero细胞的人用狂犬疫苗，评价分别添加上述两种物质的培养基培养制得的病毒收获液的质量是否冇差异，结果见图2,结果表明，重组人血白蛋白与血源人血白蛋白相比，没有显著差异。病毒滴度（%ofHSA）图2Vero细胞培养中添加rHSA与HSA病毒滴度对比3.2对地鼠肾细胞的促生长作用与地鼠肾狂犬疫苗牛产企业合作进行了重组人血口蛋口替代血源人血a蛋白的验证

6、实验。使用重组人血白蛋白（rHSA）与人血白蛋白作为培养基主要组分，用于生产人用狂犬疫苗（地鼠肾细胞），评价分别添加上述两种物质的培养基培养制得的病毒收获液的质量是否冇差异，结果见图3,结果表明，重组人血白蛋白与血源人血白蛋白相比，没有显著差异。病毒滴度（％ofHSA）■HSA组■rHSAloti■rHSAIot2■rHSAIot3图3地鼠肾细胞培养中添加rHSA与HSA病毒滴度对比3.3对屮华仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）单细胞克隆生长的支持很多包描单克隆抗体在内的牛物药物都是通过哺乳动物的培养来表达牛产的，为了

7、保证细胞的稳定性和产品的质量，产品研发初期需要进行单细胞克隆的培养和增殖，而单个的或数量很少的细胞非常不易生存与繁殖，在技术上有很大的难度。所以，通常使用胎牛血清来进行低细胞密度的培养，但是随着动物源成分的加入，必然带来监管的一系列问题。但是使用垂组人血白蛋白与化学成分明确的培养基联合进行CHO细胞单细胞克隆的培养，既能避免因外源因子污染造成的监管问题，又能有效的支持低细胞密度的细胞生长⑶。使用含重组人血白蛋白的培养基培养单细胞，经过两周的培养，成功的进行了细胞的复苏和扩增，结果见图4。1.5g/LAlbucu

8、lt3g/LAlbucultD66JX0T0h)((f-z•♦■((•0g/LAlbucultAS6HOII■(((<((•((((((.E<'■4(<]•(Ff(Jc◎JL(—■•(cf,“1□图4细胞生长分析系统（CSI）观察CHO细胞株单细胞28天的扩增图像A和D：培养基屮无人血白蛋白添加B和巳培养基中补加1.5g/l重组人血白蛋白C和F：培养基屮补加3.0g/l重组人血白蛋白