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1、幽门螺杆菌感染的诊断方法及评价徐采朴i/JAa门螺杆菌的分离培养方法自从Marshall及Warren1982年首先由人胃粘膜分离培养幽门螺杆菌（Hp）以来，因其结果呆靠，已被认为是诊断Hp的“金标准”，用以评估其他诊断方法及体外试验。1.标本收集与转送胃镜活检胃窦粘膜后应立即在培养平板上划线分离或置于转送基内，及早（最好小时内）进行分离培养。2•将2-3块胃粘膜组织放在灭菌河沙中，加菌水研磨，以1000r/min离心3分钟，取上液再以35r/min离心20分钟，除上液，取沉淀物接种于含脑心的改良SKirrow血琼脂平板上，置微氧环境（5%02,80%N2,8%C02,7%H
2、2）,湿度较充分的玻缸中,37°C培养3—4天。对可疑菌落（0.5-1.0mm大小的扁平菌落）作涂片染色和4种生化试验。凡革兰染色阴性、菌形典型、且角酶、氧化酶、尿素酶等试验吴现阳性，而马尿酸钠水解试验吴阴性者，确诊为Hp。凡7天培养仍无可疑菌落生长者为阴性。3.Hp分离培养法是诊断研究的一基基木技术，但由于技术耍求高、操作繁琐，时间长且阳性率不很高,敏感性70—92%,特异性100%,有胃镜取材之苦，故不列为临床诊断常规，而作为评价新的诊断方法、药物根除效果及体外筛检抗菌药物Z用（体外药物敏感试验）。二、组织学检查方法组织学检查亦被认为是诊断Hp的“金标准”,其敏感性93—
3、99%,特异性96-99%,常用方法有：1.WarthinStarry银染色法被认为是经典的方法，Hp呈黄色，菌体由于有银沉着而显增大，容易识别，敏感性及特异性均高，达95%左右，但技术度要求高，操作繁琐，价格刘而费时，冇被取代之趋。2.改良Giemsa染色法组织切片脱蜡，充分复水后，直接入2%Giemsa染液中30分钟后洗去染液，用100%乙醇脱水。Hp呈紫红色，形态清晰易于辨认,效果与银染相似，甚至更好，并且操作简便，价廉省时，易于一般医院普及。3.甲苯胺兰染色法组织切片脱蜡复水、水洗后用0.1%甲苯胺兰染色10分钟，洗去染液，Hp着兰色。4.HE染色法组织切片脱蜡复水后
4、用苏木索液染色15分钟，洗去染液用1%盐酸洒精分化。流水冲洗15分钟后伊红染色5分钟，结呆Hp染成淡红色。5.组织印片Giemsa染色法用无菌银子胃镜活检组织块，放在无菌载玻片上，以组织的不同面作印，然后染色镜检。Hp多在粘液层下，粘膜上皮细胞表面，呈弯曲杆状、海鸥展翅状、螺旋状、两端钝园、着色较淡。三、血清特异性抗体检测法应用酶联免疫吸附试验(ELTSA)检测患者血清特异性抗Hp的TgG和TgM抗体。1.Hp超声粉碎抗原的制备经鉴定确诊的5株Hp,在改良Skirrow培养基,微需氧37°C条件下培养3天。以PBS洗下菌落及菌苔。TOHY超声破碎品昌200W,20000Hz,
5、30分钟将Hp打碎，-20°C5000r/min离心30分钟。取上清液加入NaN3至最浓度0.1%,4°C储存备用。2.Hp阳性参考血清的制备3株Hp活菌分别接种家兔5只，28天采血。凝集效价均在1：1200以上，混合使用。3.ELISA基本程序经方陈滴定择最佳抗原浓度，包被聚苯乙烯微孔板，加入倍比稀释的被检血清，温育、洗涤后分别加入辣根过氧化物酶标记的抗入IgG和IgM,温育，洗涤后加入底物显色，终止反庆。酶联检测仪测定0D值。每板设置阴、阳性对照。大于或等于阴性对照平均0D值3倍或以上者为阳性。本组结果：IgG诊断特异性和敏感性分别为76.2%和95.2%oIgM分别为9
6、3.9%和97.1%。该法为无创性诊断方法适用于流行病学调查，缺点是不能诊断Hp现行感染，Hp被根除后，血清中抗体可以维持阳性超过半年，故不能用以判断疗效。四、聚合酶链反应检测Hp聚合酶链反应(PCR)技术是1985年发明,1990年Iloshina等首先应用,成功地检出胃粘膜活检标本中Hp01.原理利用两条与靶DNA两端互补的寡核甘引物，经酶促反应合成特异片断的体外扩增技术，包括：⑴变性：膜板【爪A加热后双链解离成两条单链；(2)退火：降温时，两个引物分别结合至两条模板的3'端；⑶延伸：在DNA聚合酶催化下，口引物的3'端开始单核甘酸，形成与模板链互补的新链，后者乂可作为模
7、板进入上述循环，经25-30个循环后即口J扩增106-109倍。2•操作方法及步骤包括：⑴模板DNA的制备：⑵扩增反应:⑶PCR扩增产物的凝胶电泳分析。3.结果特异扩增应在电泳中仅出现一条DNA条带，通常电泳阳性即可诊断Hp,亦可与扩增片段互补的探针杂交获得更确切的证明。PCR检测胃液及活检组织的敏感性96%—100%,特异性为100%o宋敏等报告，其敏感性97.3%,特异性100%,认为PCR有高效、特异、敏感、简便、迅速和可H动化等优点，可检测少至100个细菌的水平，已逐步用于检测难以培养的球形Hp
