遗传实验参考果蝇大实验转基因果蝇的杂交重组和鉴定

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1、果蝇大实验转基因果蝇的杂交重组和鉴走实验日期：4/5〜5/24实验地点：生物IH馆遗传学实验室实验者：2010080086郑世喜同组实验者：胡璞，兰陆红，谢雨辰，潘新蕾实验目的：插入在同一个染色体上的不同目的基因（分别处于两个品系果蝇中）通过重组交换整合到同一品系果蝇的同一染色体上，并得到可以稳定保存的品系（balanced或homozygous）。背景知识：转基因果蝇（transgenicfly）是将带有目的基因的质粒通过显微注射转入白眼果蝇卵中，这些质粒上一般带有P转座子序列（PelementsaretransposablepiecesofDNAthatr

2、andomlyinsertthemselvesintogenomicDNA），使得目的基因可以插入到果蝇染色体中。一般使用白眼果蝇的卵进行显微注射，质粒上带有的mini-white基因（红眼）可以作为转基因成功的标记（marker）,带有目的基因的果蝇将成为红眼果蝇omini-white的表达量决定了果蝇眼睛红色的深浅，这与目的基因插入位置和copy数目有关（可请学生思考为什么一一插入位置附近的染色体结构和启动子决定mini-white表达量，纯和果蝇比杂合果蝇表达量也高，有多个插入位点的比单个插入位点的表达量高，一般（W况下只有一个插入位点）。常用的带P转座

3、子载体示意图如下：实验提供的转基因果蝇，由于受质粒大小的限制，一般一个转基因果蝇品系只能转入一个目的基因，有时需要把不同目的基因整合到同一个果蝇品系中，硏究两个基因的功能及相互作用等。如果两个目的基因都插在不同果蝇品系的同一个染色体上，可以通过遗传重组的方法得到重组型后代（眼睛颜色），重组型后代将在同一个染色体上同时带有两个目的基因，并可以建立稳定保持的品系。例如有基因A的转基因果蝇系tA和基因B的转基因果蝇系tB,A和B分别插在tA和tB的三号染色体上（t表示transgenic）,通过重组交换可以得到三号染色体上同时带有基因A和基因B的转基因果蝇系tAB,

4、将tAB稳定保存即可。重组实验还需要带TM3平衡子（balancer）的果蝇来辅助，带平衡子的果蝇相应染色体不能发生重组，使得杂交过程和鉴定方法更为简单。另外，还需要应用到一个UAS-Gal4系统的神经细胞的driver,为GMR・Gal4,进行重组成功的鉴定。GAL4/UAS系统是目前果蝇中十分常用的实验系统（见下图说明）。该系统利用组织特异性的启动子或增强子，将GAL4基因与启动子或增强子相连接，建立GAL4转基因系，通过这种启动子以细胞和组织特异性的方式来控制GAL4的表达。另外，将UAS与靶基因融合，建立带有UAS■靶基因的转基因系。在杂交后代中，特异

5、性表达的GAL4能以同样的方式调节UAS■靶基因的表达。Iranscrip^onalactivationofg^neXTRg•第yificGxpr&sskxiofGAL4Figure1果蝇中GAL4/UAS系统（DanielStJohnston,2002）实验材料：转基因果蝇A、B/Ser（翅膀缺刻）、+/Sbbalancer（白眼，平衡子Sb,短刚毛）的果蝇以及GMR-Gal4果蝇。其中，tA果蝇系为纯合体，转入Fu基因，该转基因与GMR-Gal4果蝇系进行杂交，其在GMR-Gal4的驱动下，产生子代的成体果蝇眼睛缺陷，表现为发育不全。tB果蝇系为纯合致死，

6、带有一个Serrate（翅膀缺刻）^balancer,其自身带有GFP基因，能自发绿色荧光，在荧光显微镜下可观察。本实验中可能用到的balancer为：染色体Balancer显性表型标记(dominantphenotypicmarker)纯合(homozygous)3TM3Sb（短刚毛）致死（lethal）3TM3Serrate（翅膀缺刻）致死（lethal）实验设计：P:A/AB/Ser残刻翅A/A/SerA/B■厂A/bSGal4Gal4不涌A/+B/+AB/+/+Fz：9GMR■■厂Gal4养GMR厂厂?Gal4木9Q)GMR--I-?Gal49GMR.

7、-厂Gal4+/Sb■厂实验步骤:1.A/A和B/Ser■杂交。(我们组分别做了A/A(N)xB/Se「(2)和A/A(2)xB/Ser(；))2.他们的后代当中挑出A/B(?)o后代有A/B和A/Ser,A/SerB残刻翅果蝇，雌雄通过观察几个明显的特征来筛选挑出A/B(¥)o3.A/B(2)和+/Sb进行杂交。后代有8中可能，当中/+不会涌出来，挑出短刚毛果蝇，即，包含Sb的果蝇。(不包含/Sb)4.挑出的果蝇可能的基因是：A/Sb、B/Sb、AB/Sb。(其他果蝇都是白眼的)挑出8只雄蝇，分幵放培养瓶里，跟GMR-Gal4进行杂交。检验他们的子代既有A的

8、特性又有B的特性的。（既有眼睛缺陷又有