遗传实验参考转基因果蝇的杂交重组和鉴定

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1、转基因果蝇的杂交重组和鉴定生06郑华2010030065同组成员：刘紫薇潘周娴贺佳琳王宇宁实验日期：2012年4月4日至5月27日1.实验目的：把插入在同一个染色体上的不同目的基因（分别处于两个品系果腕屮）通过重组交换整合到同一品系果觐的同一染色体上，并得到AT以稳定保存的品系（balanced或homozygous）0图1.常用的带P转座子载体示意图实验原理转基因果蝇（transgenicfly）是将带有目的基因的质粒通过显微注射转入白眼果蝇卵中，这些质粒上一般带有P转座子序列（Pelementsaretransposablepieces

2、ofDNAthatrandomlyinsertthemselvesintogenomicDNA）,使得目的基因可以插入到杲蝇染色体屮。一般使用白眼果蝇的卵进行显微注射，质粒上带有的mini-white基因（红眼）可以作为转基因成功的标记（marker）,带有目的基因的果蝇将成为红眼果蝇。mini-white的表达量决定了果蝇眼睛红色的深浅，这与目的基因插入位置和copy数目有关,入位置附近的染色体结构和启动子决定mini-white表达量，纯和果蝇比杂合果蝇表达塑也高，有多个插入位点的比单个插入位点的表达量高，一般情况下只有一个插入位点。有

3、基因A的转基因果蠅系tA和基因B的转基因果蠅系tB,A和B分别插在tA和tB的三号染色体上（t表示transgenic）o带平衡子的果蝇相应染色体不能发生重组，使得杂交过程和鉴定方法更为简单。另外，还需要应用到一个UAS-Gal4系统的神经细胞的driver,为GMR-Gal4,进行重组成功的鉴定。GAL4/UAS系统是目前果蝇中十分常用的实验系统（见下图说明）。该系统利用组织特异性的启动子或增强子，将GAL4基因与启动子或增强子相连接，建立GAL4转基因系，通过这种启动子以细胞和组织特异性的方式來控制GAL4的表达。另外，将UAS与靶基因

4、融合，建立带有UAS•靶基因的转基因系。在杂交后代中，特异性表达的GAL4能以同样的方式调节UAS■靶基因的表达。图2.果蝇中GAL4/UAS系统(DanielStJohnston,2002)3.实验材料转基因果蝇A、B/Ser（翅膀缺刻）、+/Sbbalancer（白眼，平衡子Sb,短刚毛）的果蝇以及GMR-Gal4果蝇。其中，tA果呢系为纯合体，转入Tau基因，该转基因与GMR-Gal4果蠅系进行杂交，其在GMR-Gal4的驱动下，产生子代的成体果蝇眼睛缺陷,表现为发育不全。tB果蝇系为纯合致死，带有一个SerrateC翅膀缺刻）的ba

5、lancer,其自身带有GFP基因，能自发绿色荧光，在荧光显微镜下可观察。本实验中可能用到的balancer为：染色体Balancer显性表型标记(dominantphenotypicmarker)纯合(homozygous)3TM3Sb（短刚毛）致死(lethal)3TM3Serrate（翅膀缺刻）致死(lethal)4.实验方案因为要使A基因和B基因在同一条染色体上，又要稳定遗传，保证自由重组或者交叉互换都不会带来变界，因此目标蝇应含纯和致死的平衡子，即为AB/Sb或者AB/Sero我们选择的是得到AB/Sbo其自交结果如下，可以保证自

6、交稳定。ABSbABB纯和致死AB/Sb,保持性状稳定SbAB/Sb,保持性状稳定Sb纯和致死我们小组采用了两套方案，第一套方案和多数其他小组差不多，风险较小，但实验时间较长；方案二比方案一少杂交一代，但是得到所需要的目标蝇在杂交后代屮的概率更小，需要更多的杂交后代以保证能够跳出目标杲蝇。两种方案具体如下：未加注明的性状默认为野生型。其中蓝色的字是实际操作吋使用的果蝇数目和日期。4•工.方案一P：13只A/A2x6只B/ser（残翅）i＞（4月10日22:00）IFi：zA/B（非残翅），A/ser（残翅）此处挑选非残翅处女蝇。fFi:11

7、只A/B早x5只+/Sb£（短刚毛）（4月23口23:00）F2：ABAB++A/+红眼B/+（红眼绿色荧光）AB/+（红眼绿色荧光）+/+（白眼）SbA/Sb（红眼短刚毛）B/Sb（红眼绿色荧光短刚毛）AB/Sb（红眼绿色荧光短刚毛）+/Sb（白眼短刚毛）此处挑选红眼短刚毛的雄性。因为该步骤需要将红眼短刚毛的果蝇挑出，一个一个分离出来与GMR-GAL4/GMR-GAL4杂交，已验证其是否含有A基因。而如果一个瓶子里雌果蝇只有一只，产卵量较少，卵不易孵化，因此此处选择的红眼短刚毛果蝇应为雄性。因为用紫外线照射检验荧光可能会影响雄蝇的牛殖能力

8、，故在对B基因的检测放在对A基因检测的后面。出于同样原因，在GMR-GAL4/GMR-GAL4雌蝇产卵之后，将雄蝇先转移出来和+/Sb雌蝇杂交，待+/Sb也产卵以后，再检验F2雄