资源描述：
《线虫研究相关技术》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、线虫研究相关技术1•线虫的培养和分离（1）破开己感染南方根结线虫的芹菜根系，在实验室内通过贝尔曼漏斗法提取虫体。从所得虫体屮挑取卵囊，卵囊用0.2%次氯酸钠溶液消毒0.5min后,经无菌水冲冼。置卵囊于无菌水屮孵化，取2d后孵出的线虫（2龄线虫，简称J2）供测定用。（刘晟，等，2009）（2）根结线虫：挑取人工接种南方根结线虫的番茄根，用组织捣碎机打碎，依次过200、325、500目线虫标准筛，用无菌水冲洗500目筛上的虫卵置于无菌水中孵化，取第2d孵化出的活幼虫（2龄幼虫，简称J2）供测试。（赵卫星,等，2006）o（3）线虫的扩大培养：将采集到的受马
2、铃薯严重危害的马铃薯薯块用自来水冲洗干净，剖开病薯，用刀切成薄片，然后用银子将病薯撕成小块，待用。在漏斗底部铺上两层餐巾纸，将切好的病薯小块放入漏斗中加入无菌水，下面用带止水夹的橡胶管相连，每隔12h左右打开止水夹用烧杯接取橡胶管中下部的液体备用o将分离到的线虫用无菌水洗出，冲入无菌的指型管中，用0.5%的次氯酸钠消毒2min,然后用无菌水冲洗2〜3遍，使线虫自然沉降或用离心机使线虫快速沉淀（6000/rpm,3min）。再在离心管屮加入各约SOOmg/kg的链霉素（100万单位/g）,保持lh,离心后吸出消毒液。再用无菌水冲洗3遍，定容到一定体积后放在
3、4°C冰箱中保存备用。在PDA（约20ml）平板培养基上接入灰葡萄砲菌cinereaPers）,25°C温箱中暗培养。待菌丝长满整个培养皿后，在培养基中央刻一小口，加入消毒过的马铃薯茎线虫约500条，将培养皿用封口膜（Parafilm）包好并正置放入25°C温箱中黑暗培养。接种培养2〜3d后将培养皿皿盖朝下放置，继续培养35〜40d左右，然后将培养皿皿盖上的线虫用无菌水冲洗到烧杯中备用（闫磊,2007）o（4）线虫的扩大培养：参照刘维志（2000）描述的方法，略作改进。釆用根结线虫的适宜寄主番茄（品种为毛粉802）进行繁殖，貝体方法为：采用常规方法育苗，
4、当待接种的番茄苗长出3〜4片真叶时，将其移入装有高温灭菌砂壤土（粗砂:±=1：1）的花盆中，每盆2株；摘取南方根结线虫卵囊或制各南方根结线虫二龄幼虫（J2）悬浮液接种，每盆接种100个卯囊或5000个卵或幼虫:接种后花盆摆放在日光温室工作台上，根据情况，每2〜3天浇水一次，每隔10天施植物全营养液一次；培养40〜60天，扣盆取根系摘卵囊或取土分离根结线虫，供试。卵的分离及卵悬浮液的制：各参照刘维志（2000）的方法，将带有大量根结和卵囊的病根小心冲洗干净，剪成lcm长根段，并与适量水一起放入组织捣碎机中,搅拌20〜30s,将搅拌器中根碎片同溶液一并倒入孔
5、径为75um（200目）、26pm（500口）组筛内，用自来水冲洗75urn网筛上的根碎片，以便尽可能在孔径26urn网筛上冋收线虫卵，将孔径26urn网筛内的线虫卵收集于烧杯屮,定容，并在休式显微镜（帯有底光源）下计数。2•杀线虫活性测是（1）测定各萃取物对南方根结线虫的杀虫活性。方法如下：将各组分减压浓缩后用少量丙酮（低于1%）溶解，滴加少量吐温・80（低于0.1%）乳化，加蒸憾水配制成lOOpg/mg的约液，取ImL用J2悬浮液（100头线虫/mL）稀释2.5倍，置于（28±l）r的培养箱内，分别于24、48h后观察皿的存活情况，统计线虫的存活数、
6、死亡数，计算校正死亡率。以清水为对照，每个处理3次重复，线虫死亡记数标准参照文献，即线虫僵直不动的为死虫，呈弯曲蠕动状态为活虫。杀线虫活性的评价标准按Chandravadana等的方法进行。（赵卫星等,2006）o（处理线虫死亡率-对照线虫死亡率）线虫校正死亡率（％）=x100（1-对照死亡线虫率）（2）液浸渍法：各供试提取物以蒸徭水（含（p<2%的丙酮）配制成试验设置浓度的溶液，取1.5mL溶液加入24孔细胞板内，然后用胶头滴管加入供试松材线虫50〜100条，每孔作为1次重复，每处理4次重复，对照为蒸储水（含林2%的丙酮），置25°C培养箱处理24、4
7、8和72h后，在光学显微镜（4x）下检查线虫死亡数.以虫体发直、拨针拨动不活动的虫体放人清水24h后仍不能恢复活动的确定为死亡状态，按下式计算校正死广率。（马伏宁等，2009）（处理组死亡率-对照组死亡率）校正死亡率=x100%（1-对照组死亡率）（3）室内毒杀活性测定（药液浸泡法）:试验在24孔细胞培养板内进行，先将同样体积（VJ定容好的线虫悬浮液注入样品孔内，再根据试验浓度按式（3）计算需要补充添加的无菌水（V2）,最后加入相应量的药剂母液（V3）,混合均匀，置于25°C培养箱中，每处理4个重复，每重复50〜100条线虫。处理后24h,48h,72h
8、分别检查各处理的线虫死亡与存活情况，按下列公式分别计算线虫死亡率和线虫的校正死亡
