下呼吸道感染病原学分子诊断技术进展浅析

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1、下呼吸道感染病原学分子诊断技术进展浅析下呼吸道感染是一种常见的感染性疾病，严重危害人类健康。据世界卫生组织的统计，2008年全球下呼吸道感染的病死率为6.1%,居人类十大死因的第3位。下呼吸道感染的常见病原体包括细菌、病毒、支原体、衣原体及寄生虫等。研究结果显示，对病原体准确可靠的诊断是有效控制下呼吸道感染、提高治愈率和降低细菌耐药性的重要保证。但目前临床常规采用的细菌培养、病毒分离等病原学检测技术普遍存在着耗时长、敏感度差等不足，大大降低了检测效率，难以对临床抗感染治疗发挥有效的指导作用。近年来，随着分子生物学的飞速发展

2、，病原学诊断与分子生物学技术密切结合，形成了病原学分子诊断技术。这一新兴技术的崛起，彻底打破了传统的主要靠培养检测的局限性，并凭借其快速、准确、敏感及特异等优势在病原学诊断方面凸显作用，为下呼吸道感染的诊断、治疗及新型病原体的检出和细菌耐药机制的研究等方面提供可靠的技术支持。现将下呼吸道感染的病原学分了诊断技术的进展综述如下。一、核酸检测分子生物技术最早用于病原学诊断是从核酸检测开始。核酸检测技术发展至今，大致经历了核酸杂交、分离、扩增及基因芯片、PCR、DNA图谱分析及DNA测序等技术。1.核酸朵交：最早出现的核酸朵交技

3、术是利用生物素、放射性同位素、酶等标记的探针与样品的核酸片段进行杂交，通过检测特异的杂交信号确定病原体。该技术的特点是特异度和敏感度均高，几乎接近100%,特别是后续发展的荧光原位杂交FISH技术,在病原学分子诊断的早期起到了至关重要的作用。核酸杂交技术的关键在于探针的设计，目前，军团菌探针、肺炎支原体探针、EB病毒探针、呼吸道合胞病毒探针及肺抱子菌探针等已陆续问世，使下呼吸道感染的典型和非典型病原体的诊断成为可能。Edelstein等制备的cDNA探针具有军团菌属的特异性，经美国基因探针公司改进后，成为商用探针试剂盒，己

4、被临床实验室采用。Hyman等制备的DNA探针可检出含量仅为0.1ng的肺炎支原体DNA。Hernandez等采用核酸朵交技术成功检测到呼吸道合胞病毒。核酸朵交技术是其他核酸检测的基础，为病原学分了诊断的开展迈出了重要的一步。2.聚合酶链反应PCR：自20世纪80年代问世以来，PCR技术被广泛应用于各个领域，具有划吋代的意义。从最早的标准PCR,逐渐发展到多重PCRmultiplexPCR、巢式PCRnestedPCR>反转录PCRRTPCR以及实时定量PCRrealtimequantitativePCR等，目前PCR技术

5、已有十几种,其扩增能力和精确性逐步提高。标准PCR主要是针对某单一基因片段进行扩增，多重PCR可同时扩增多个基因片段，而巢式PCR以及目前广泛应用的实吋定量PCR在检测准确性方面则更具优势。众所周知，对于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等苛养菌以及嗜肺军团菌、肺炎支原体等非典型病原体来说，临床分离、培养难度很大，大大降低了临床检出率，而PCR技术可以弥补这一缺陷。Morozumi等采用实时定量PCR技术，从429例成人和儿童肺炎临床标本中检测到肺炎链球菌的lytA基因、军团菌的mip基因以及肺炎支原体的16SrRNA,整个检测过程

6、仅耗吋2h,且与传统的细菌培养方法相比，敏感度和特异度均大大提高。除了上述病原体外，Kawazu等还应用实时定量PCR技术在呼吸道分泌物中检测到了曲霉，突破了曲霉培养的种种限制。不仅针对细菌,PCR技术在病毒诊断方面也毫不逊色oBeckham等利用反转录PCR方法对194例合并呼吸道病毒感染的COPD患者的咽拭子样本进行了病毒检测并与常规分离和血清学检测方法进行了比较，结果发现PCR方法的病毒检出率为41.8%,而常规方法的检出率仅为23.4%,这一结杲对于COPD急性发作患者的病原学快速诊断颇具意义，还可以指导用药，缩短

7、患者住院时间。国内对于病原体PCR诊断的研究也十分迅猛，方健等利用PCR技术可同时检测15种呼吸道病原体。2003年SARS暴发期间，研究者正是采用了实时定量PCR技术和DNA测序技术才能在短短3个月内将SARS的元凶锁定为新型冠状病毒。2009年，我国发现的新型布尼亚病毒也是应用了此项技术。另外，PCR技术在检测细菌耐药方面也发挥了重要作用。研究结果表明，与细菌耐药和关的因子如新德里金属B内酰胺酶1、超广谱B内酰胺酶ESBL、青霉素结合蛋白2aPBP2a＞外膜孔蛋白OprD等都有对应的基因片段，因而可以通过设计不同的引物

8、来检测这些基因。Diene等采用实时定量PCR技术检测了128株菌株中NDM1基因，显示了该技术对碳青霉烯类抗生素耐药机制研究的快速、敏感等优势。管希周等利用多重PCR技术发现了同吋产AmpCB内酰胺酶AmpC和ESBL的肺炎克雷伯杆菌及其耐药表型。应用PCR技术进行耐药研究，避免了细菌分离、培养及药敏