哺乳动物体细胞克隆

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1、哺乳动物体细胞克隆一、克隆的发展概述1938年，德国胚胎学家Spemann建议把一个受精卵的细胞核去掉，然后将发育到较高阶段的细胞核放进去，观察核能否发育，这就是核移植（nucleartransfer,NT）的开始。但因当时技术条件所限，未能付诸实践，这已经成为当今克隆技术的蓝图。按照供体细胞的类型不同将核移植的发展过程分为三个阶段第一阶段是用早期胚胎细胞的卵裂球作为的核移植第二阶段是用体细胞核进行的核移植第三阶段是异种克隆日期动物种类技术特点1981小鼠胚胎细胞1983小鼠NT+电融和1986羊8-16细胞胚胎1

2、994绵羊胎儿胚盘(embryonicdisc,ED)体外培养获得细胞系1997猴早期胚胎的卵裂球第一阶段是用早期胚胎细胞的卵裂球作为的核移植日期动物种类国家1997绵羊英国1998牛日本1998小鼠美国2000猪美国2002猫美国2002兔法国2003马意大利2003骡美国2003大鼠法国2005狗韩国2007狼韩国第二阶段是用体细胞核进行的核移植日期动物种类1998“贵妇”珍稀母牛2000野黄牛（Bosgaurus）2001“Noah”牛2001欧洲盘羊第三阶段是异种克隆成功的哺乳动物克隆要事统计表克隆动物供体

3、细胞种类受体细胞种类作者发表时间小鼠合子核受精卵Mcgrath和solter1983绵羊4-16细胞期胚胎卵母细胞Willadsen1986牛4-细胞期胚胎卵母细胞Prather等1987小鼠8-细胞期胚胎2-细胞胚胎Tsunoda1987免8-细胞期胚胎卵母细胞Stice和robl1988猪4-细胞期胚胎卵母细胞Prather等1989牛内细胞团卵母细胞Sims和first1993猴子4-32细胞期胚胎卵母细胞Meng等1997小鼠内细胞团和滋养层细胞卵母细胞Tsunoda和kato1998绵羊培养的胚盘细胞卵母

4、细胞Campbell等1996绵羊乳腺细胞卵母细胞Wilmut等1997牛培养的卵丘及输卵管上皮细胞卵母细胞Kato等1998小鼠新鲜分离的卵丘细胞卵母细胞Wakayama等1998牛转基因胎儿成纤维细胞卵母细胞Wells等1998珍稀牛培养的成年珍稀牛颗粒细胞卵母细胞Cibelli等1998山羊转基因胎儿成纤维细胞卵母细胞Baguisi等1999小鼠成年雄性小鼠尾尖细胞卵母细胞Makayama和Yanegicechi1999小鼠胚胎干细胞卵母细胞Wakayama等1999牛17岁牛耳成纤维细胞卵母细胞Kubota

5、等2000猪胎儿成纤维细胞卵母细胞Onishi等2000猪培养的成年猪卵丘细胞卵母细胞和爱精卵Pojejaeve等2000猪胎儿成纤维细胞卵母细胞Betthauser等2000盘羊盘羊颖粒细胞卵母细胞Loi等2001猫培养的成年猫卵丘细胞卵母细胞Shin等2002免卵丘细胞卵母细胞Chesne等2002二、克隆的研究方法常规方法连续核移植方法2N-4N嵌合体产生完全来源于供核细胞激活去核卵母细胞取出核核供体动物重构克隆胚胎电融合供核细胞MII期卵母细胞注入支核卵母细胞间周隙注入去核卵母细胞与去核卵母细胞共培养移植体

6、外培养发育的胚胎体内培养克隆动物代孕母示成熟卵母细胞超排卵巢体外成熟胞质供体动物哺乳动物克隆程序常规哺乳动物克隆程序卵母细胞体外成熟A：刚抽出的卵母细胞；B：IVM（体外成熟）19小时的卵母细胞；C：成熟的卵母细胞体细胞移植过程A-E：盲去法；F-J：挤压法体细胞核移植重构胚体外发育各阶段A：核移植；B：融合卵；C：2细胞；D：4细胞；E：8细胞；F：8-16细胞；G：16细胞；H：32细胞；I：囊胚；J：孵化囊胚连续核移植A：培养贴壁的体细胞、B：消化下来供体核移植的体细胞、C体细胞核移植、D：重构囊胚经链霉蛋白

7、酶消化掉透明带、E：经无钙离子、镁离子的培养液处理后分离成单个卵裂球、F：连续核移植、G：融合卵、H：重构囊胚连续核移植方法卵母细胞受精卵培养的体细胞三种连续核移植方法示意图（黑色箭头：体细胞核移植；红色箭头：以重构胚裂球作为供核；蓝色箭头：原核互换；紫色箭头：2-细胞互换）卵母细胞2N-4N嵌合体产生完全来源于供核细胞受精卵2-细胞电融合形成4倍体胚胎2N的ES细胞4N胚胎细胞来源的胎盘体外培养的ES细胞系2N的ES细胞内细胞团卵母细胞培养的体细胞三、动物克隆的应用治疗性克隆与转基因技术结合生产转基因克隆动物拯救

8、濒危动物治疗性克隆病人移植去核卵母细胞休细胞活检胚胎分裂囊胚造血干细胞肌肉细胞诱导分化神经细胞（胚胎干细胞）内细胞团培养免疫手术法体细胞核移植内细胞团基因打靶动物核供体动物动物胚胎胎儿成年动物ES←PGCs卵裂球胎儿成纤维细胞各种体细胞基因打靶细胞系细胞系细胞系显微注射基因转染←外源基因打靶载体分子生物学超排重构胚代孕母克隆动物供核细胞克隆技术动物囊胚注射胚