哺乳动物体细胞克隆技术研究现状及其存在的问题

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1、哺乳动物体细胞克隆技术研究现状及其存在的问题1马志杰(生命科学与技术学院遗传育种与繁殖专业四川成都610041)摘要哺乳动物体细胞克隆技术的成功是生物高新技术的重大突破具有划时代里程碑的作用本文介绍了哺乳动物体细胞克隆技术的基本环节关键技术及研究现状并就其意义和存在的问题作了概述然后对其发展前景作了展望关键字:哺乳动物体细胞重组胚胎克隆1997年2月英国Rosolin研究所的科学家Wilmut等人宣布了克隆羊多莉的诞生[1]它是迄今世界上科学家首次用高度分化的体细胞即乳腺上皮细胞为核供体进行核移植培养出来的哺乳

2、动物相对于之前的动物克隆技术而言哺乳动物体细胞克隆是一次质的飞跃自多莉诞生以后体细胞克隆技术发展迅速经过5年多的时间此项技术得到了较大的改进并获得了重要的理论成果与实际应用然而体细胞克隆技术还存在理论与技术上的缺陷与不足1克隆的概念及体细胞核移植克隆(clone)一词源于希腊语其含义是无性繁殖即由一个祖先细胞分裂繁殖产生的纯细胞系在这个细胞系中每个细胞的基因彼此相同哺乳动物克隆又称核移植技术是通过特殊的人工手段显微操作电融合等对哺乳动物特定发育阶段的核供体胚胎细胞或体细胞及相应的核受体去核的原核胚或成熟的卵母细

3、胞进行体外重构体外培养胚胎移植从而产生动物个体的过程通过核移植产生的动物其遗传结构与细胞核供体完全[2]相同在核移植过程中所用的供体细胞若为体细胞则称为体细胞核移植2哺乳动物体细胞克隆技术的主要环节及其研究现状哺乳动物体细胞克隆技术主要包括以下5个主要环节(1)供体核的准备;(2)受体细胞质的选取;(3)核质重组融合激活技术;(4)重组胚的体内或体外培养;(5)重组胚胎的移植2.1供体核的准备最早人们用青蛙肠粘膜上皮细胞的核作为供体核获得后代Wilmut等人以乳腺上皮细胞为核供体在特定的实验条件下获得了克隆绵羊

4、多莉实验表明在哺乳动物体细胞克隆中并非一切体细胞都可作为供核细胞进行核移植胎儿成纤维细胞因在克隆前能进行基[3]因修饰故目前大多数家畜的克隆都以它为供核细胞另外输卵管及子宫上皮细胞卵丘细胞颗粒细胞耳细胞等也可作为供核细胞一般研究认为诱导处于不同分化期的细[4]胞进入静止期是体细胞克隆成功的关键之一Campbell(1996)认为处于休眠期的体细胞核在克隆中才能发育并首次采用血清饥饿法使供核细胞同期化在Go期结果提高了体[5]细胞克隆的成功率也有科学家对此提出质疑Cibelli等(1998)根据其克隆牛的经验指[

5、6]出饥饿过程并不是一个必要的过程Boquest等(1999)证明在处于活跃分裂期的仔猪[7]胎儿成纤维细胞培养物中有一小部分细胞处于静止期Kubota等(2000)的实验表明1本文作者马志杰收稿日期2003060611血清饥饿培养对核移植胚胎融合率卵裂率及囊胚率的影响不显著但对重组胚胎的妊娠成功率有较大的影响也就是说饥饿法处理有助于重组胚胎后期的发育因此在当前体细胞克隆成活率低的情况下选用血清饥饿法处理供核细胞以期获得较高的成功率仍[8]是明智之举2.2受体细胞质的选取[9]研究人员早期曾以受精卵或去核2-细

6、胞胚作为受体卵Willadsen等(1986)的绵羊胚胎细胞核移植试验说明成熟卵母细胞比受精卵或2-细胞胚更适合于用作核移植的受体细胞质它能使各个发育时期胚胎甚至体细胞核的重构胚胎恢复到受精卵的状态重新编序正常发育直到出生近年来通常以第二次减数分裂中期卵母细胞取代原核受体解决核受体问题1999年美国Wisconsin-Madison大学研究人员采用绵羊猪猴或大鼠的皮[10]肤成纤维细胞作为供核体细胞移植到去核牛卵母细胞中获得成功卵母细胞采集后在培养液中培养成熟至第一极体排出进行去核处理一般去核的方法有盲吸法半卵

7、法和功能性去核法以往很多人采用盲吸法此法常吸去过多的受体细胞的细胞质且去核成功率只有60%左右效果不佳现在普遍采用事先给其DNA染色的方法去核效果可达90%以上具体步骤是事先在HSOF一类的培养液中加10%胎牛血清(FBS)5ìg/mlHoechst33342和7.5ìg/ml细胞松弛素B制成染色剂将待去核卵母细胞放置在染色液中培养10-20分钟在DNA被染色后吸到玻璃管中的细胞核可以在紫外光下透[8][11]过管壁观察到因此熟练的工作人员可使去核效率大大提高丹麦的Vajta等(2001)发明了一种新的核移植方

8、法基本过程为培养的卵母细胞至成熟涡旋去掉卵丘细胞于0.5%的链蛋白酶中培养5分钟去除卵细胞的透明带用显微分割刀将卵母细胞平均分成两半紫外光下挑选不含染色体的胞质体继续培养2-3小时,再先后与一个细胞核供体体细胞和另一个不含染色体的胞质体进行融合形成双胞质体-体细胞三联体的重组胚胎这一方法大大提高了卵母细胞的去核率简化了预备工作且实验技术要求低预计在体细胞核移植中将会被广泛采用在体细胞核