动物寄生虫病pcr诊断技术

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1、动物寄生虫病PCR诊断技术动物寄牛•虫病PCR诊断技术聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)技术是一种既敏感又特异的DNA体外扩增方法，它可将一小段目的DNA扩增上百万倍，其扩增效率使得该方法可检测到单个虫体或仅部分虫体的微fiDNAo通过设计种、株特界的引物，此法只扩增出种、株特界的PCR产物，具冇很高的特异性。而H.PCR技术的操作过程也相对简便快捷，无需对病原进行分离纯化；同时可以克服抗原和抗休持续存在的干扰，直接检测到病原体的DNA,既可川于虫种、株的鉴别，动物寄纶虫病的临床诊断，乂可用于动物寄牛•虫病的分子流行病学调査。

2、随着PCR技术的不断完善与发展，它已广泛应用于分了生物学、生物技术、临床庚学等各个领域，具有广泛的应用前景。一、实验目的要求掌握PCR诊断技术所涉及实验的基本原理，全面熟悉PCR诊断技术的操作过程，其屮包括寄生虫DNA的捉取、PCR引物的设计、PCR条件的优化、对目的片断的扩增、琼脂糖凝胶电泳及结果分析、PCR产物的纯化等等。二、实验仪器和材料(一)寄牛虫基因S1DNA的提取及纯化1.虫体材料。单个虫体。2.器具。超净工作台、恒温培养箱、TGL-16G高速台式离心机、旋涡振荡器、微量取液器及配套吸头、微量离心管、一次性注射器、微型眼科锻、微型眼科剪丿J、玻璃平皿

3、、滴管、有机架等。3.试剂。(1)乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA)、十二烷基磺酸钠(Sodiumdodecylsulfate,SDS)^三(径甲基)氨基甲烷•盐酸(Tri(Hydroxymethyl)Aminomcthanc-HCl,Tris-HCl).氯化钠、蛋白酶K(25

4、.ig/

5、il)>异内丽(80%)、双蒸水、灭菌超纯水等。(2)DNA裂解液：500mMNaC170pl、100mMTris-HCl(pH8.0)30pl、50mMEDTA(pH8.0)150卩1、10%SDS30yl。(3)Wizar

6、dTMDNAClean-Up试剂盒或类似的DNA捉取试剂盒。(二)PCR扩增及琼脂糖电泳1.材料。提纯的虫体DNAo2.器具。超净工作台、微型高速台式离心机、微量取液器(2/20/200/1000卩1)、PCR扩增仪、琼脂糖电泳系统、凝胶成像系统、微波炉、4°C/・20°C冰箱、紫外透射仪、微型离心管(200/500/1500»1)、有机架、一次性手套、透明胶带、量筒(100ml)、三角瓶(500ml)等。3.试剂。(1)lOxPCRBuffer(无Mg2+)、dNTP(2.5mMeach)、ddH2O、MgC12(25mM)、Primers>ExTaq酶(5U

7、/1)、琼脂糖、EB(10mg/ml)、Tris碱、硼酸(Boricacid)、去离了水、EDTA(0.5mol/L,pH&0)、10x载样缓冲液。(2)0.5xTBE缓冲液：准确秤取Tris碱5.4g,硼酸2.75g,充分溶解于800ml去离子水中,加10ml0.5moI/LEDTA(pH&0),用去离子水定容至1000ml0(三)PCR扩增产物的纯化1.材料。PCR扩增产物。2.器具。TGL-16G高速台式离心机；三用电热恒温水箱；微量取液器(2/20/200/1000卩1)、琼脂糊电泳系统、微波炉、电子天平、4°C/・20°C冰箱、紫外透射仪、微型离心管(

8、500/1500卩1)、有机架、透明1胶带、一次性注射器、量筒(100ml)、三角瓶(500ml)、手术刀、保鲜纸等。3.试剂。琼脂糖；0.5XTBE缓冲液；UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒;UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒；异丙醇(80%)等。三、实验方法、步骤和操作要领(一)寄生虫基因组DNA的提収及纯化1.实验原理。应根据研究目的來决定是从单个虫体还是多个虫体提取基因纽DNAo寄主虫虫体的各个部位都可以作为基因组DNA的抽提材料，如果虫体较人的话可取其中部而保存其头部及尾部，以备形态学鉴定以验证其种类。如果虫体较小(小于lcm),则应使用整条虫体

9、抽取DNAo若虫体特别细小(例如幼虫)，可用多条虫体来提取DNAo为了获得高含量、高纯度的DNA,最好使用新鲜材料。从冻干或50%・70%乙醇保存的寄牛虫材料中也可鮫容易地提取DNAo寄生虫DNA的抽提方法有多种，不同种类的寄生虫虫体都有其最适合的抽提方法，但各种方法的基本原理都一样，即先用机械的方法将虫体组织破碎，然后加入DNA裂解液和蛋白酶K,充分作用后，虫体组织中的细胞膜破裂，蛋白质变性，将虫体基因组DNA释放到溶液中。在裂解过程中，虫体细胞碎片及大部分蛋白质会相互缠绕成大型复合物，后者被DNA裂解液屮的SDS包盖，通过离心沉淀，这些复合物会从溶液中沉淀卜

10、來，变性剂也同吋被除去，