实验四PCR技术在动物传染病诊断中的作用

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1、PCR技术在动物传染病诊断中的应用实验四聚合酶链式反应polymerasechainreaction聚合酶链反应(Polymerasechainreaction)简称PCR，是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。PCR又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍。模板DNA或RNA特异性引物:sense和antisenseTaq酶：耐热DNA聚合酶dNTPsMg2+PCR缓冲液：10mmol/LTris-HClpH8.450mmol/LKClMg2+0.1mg/

2、mL乙酰BSAPCR体系基本组成成分模板DNAMg2+dNTPTaq酶引物引物设计注意事项引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，两条引物3’端若互补，或者单条引物自身形成发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。可在

3、引物设计时加上限制酶位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。通常应在5‘端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。引物设计注意事项引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应，因为GC含量决定了DNA双链的解链温度（Tm）。另外，上下游引物的GC含量不能相差太大。△G值是指dna双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端△G值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间△G值相对较高的引物。引物的3’

4、端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。引物的设计的总原则：扩增的效率和特异性长度：15—30bp碱基尽可能随机分布（G+C含量40-60%）引物内部不能形成二级结构两引物间没有互补链存在3’端一定要与模板严格配对5’端可引入突变，加酶切位点等辅助软件：primer5，Oligo，DNAsis等PCR反应体系—引物primer5.0操作界面Xmol/L＝OD260/A

5、(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)X:引物摩尔浓度,A、C、G、T:引物中4种不同碱基个数。PCR反应体系—引物浓度计算一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，过低则降低产量。利用紫外分光光度计,可精确计算引物浓度，在1cm光程比色杯中，260nm下，引物浓度可按下式计算：dNTP应用NaOH将pH调至7.0，并用分光光度计测定其准确浓度。dNTP原液可配成5-10mM/L并分装，-20℃贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为2.

6、5mM/L。当dNTP终浓度大于50mM/L时可抑制TaqDNA聚合酶的活性。4种dNTP的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。PCR反应体系—4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)Mg2+浓度对TaqDNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+浓度范围为0.5-2mmol/L。对于一种新的PCR反应，可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+进行预备实验，选出最适的Mg2+浓度。在PCR反应混合物中，应尽量减少有

7、高浓度的带负电荷的基团，例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+离子浓度的物质，以保证最适Mg2+浓度。PCR反应体系—Mg2+TITRATEYOURMg2+CONCENTRATION!43.532.521.51mMNormally,1.5mMMgCl2isoptimalBestsuppliedasseparatetubeAlwaysvortexthawedMgCl2Mg2+concentrationwillbeaffectedbytheamountofDNA,primersandnucleotides就模板DNA而言，

8、影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。一般反应中的模板数量为102-105个拷贝，对于单拷贝基因，这需要0.1μg的人基因组DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大肠杆菌DNA。扩增多拷贝序列时，用量更少。模板量过多则可能增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率。PCR反应体系—模板模板核酸的量与纯化程