荧光定量pcr技术在牛病诊断中的应用

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1、荧光定量PCR技术在牛病诊断中的应用孙田蒋向君董燕萍单玉平李锋张雪君张佳张超江苏省连云港市畜牧兽医站江苏省连云港市动物卫生监督所摘要：荧光定量PCR技术发展于20世纪90年代，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、全封闭反应等优点，在医学和牛物学领域己经得到广泛应用。木文主要对荧光定量PCR技术在牛病诊断中的应用进行综述，以期为牛病防控提供技术参考。关键词：荧光定量PCR;牛病;检测;荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，通过标准曲线对未知模板进行定量分析的技术。近些

2、年来，市级兽医实验室陆续购置荧光PCR仪，结合血清学试验、酶联免疫吸附试验等，用于一些重大动物传染病的诊断，例如高致病性禽流感、狂犬病、猪瘟等，其他动物疾病鲜有涉及。笔者就该技术在口蹄疫、布鲁氏菌病、传染性牛鼻气管炎、牛病毒性腹泻、牛结核病等牛病诊断中的应用进行综述，以期为牛病的综合防控提供一些技术参考。1口蹄疫检测口蹄疫是一种危害偶蹄动物的重大传染病。该病传播速度惊，具有高度传染性，一旦发生将带来经济效益的大幅下降。此病收到全世界的高度重视，世界动物卫牛组织(OIE)将该病列为A类动物疫病，国内列为一类动物疫病，江

3、苏省列为优先防治病种。因此迅速准确的诊断对于口蹄疫防控尤为重要。花群义等按照FMDV聚合酶3D基因序列保守部分，设计特异的引物和探针，扩增保守区域的FMDV0型、A型、C型、Asia1型、SAT1-3型序列，建立荧光RT-PCR方法，2〜4h之内可得结果。目前市面上已有针对口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测试剂盒，取水疱皮、水疱液，血清，OP液等就可鉴定出病毒及其血清型，耗时短、假阳性率低。2布鲁氏菌病检测布鲁氏菌病是由布鲁杆菌所引起的一种人畜共患传染病。目前兽医实验室主耍通过虎红平板凝集试验初筛、试管凝集试验确诊。实际

4、工作中诸多因素困扰着布病的检测，如在感染早期抗体浓度低，试验易产牛假阴性;与其他细菌交叉反应，试验易产生假阳性;从初筛到确诊步骤繁琐，需2d吋间。高正琴等根据该基因组屮16SrRNA片段设计相应的引物和探针，创建荧光定量PCR方法，检测时间仅需2h。目前布鲁氏杆菌实时荧光PCR试剂盒已经面市，为检测布鲁氏菌病提供新的技术手段。3牛传染性鼻气管炎检测牛传染性鼻气管炎是一种牛呼吸道传染病，由由牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)引起。1BRV感染可引起持久感染和免疫抑制等隐性感染，大大降低牛的生产力和繁殖力。当前兽I矢实验室

5、诊断以血清中和实验、病毒分离鉴定和ELISA为主，步骤繁琐，检测耗时长。唐泰山等按照IBRV基因组中gB和gE序列，设计相应的引物和荧光探针，建立了检测TBRV和鉴别gE基因缺失疫苗株和野毒株的荧光定量PCR方法。冃前已研制出牛疱疹病毒I型实时荧光PCR检测试剂盒，采集牛鼻咽拭子、生殖器分泌物等就可实现快速检测。4牛病毒性腹泻病检测牛病毒性腹泻病是由牛病毒性腹泻病毒(BVDV)引起的一种传染病。感染牛可终身带毒，生长发育迟缓，繁殖力下降，对养牛业危害巨大。郭锐等以BVDV保守基因序列为参考，设计引物和探针，建立检测此

6、病毒的荧光定量PCR技术。日前已研发岀该病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒，可用于快速检测。5牛结核病检测牛结核病主要是由牛型结核分枝杆菌引起的一种人兽共患传染病。OIE将其列为B类疫病，我国将其列为二类动物疫病。江苏省结合当地情况，每年至少进行一次集中监测。兽更实验室常用的检测牛结核分枝杆菌方法一是PPD皮内变态反应,此技术不能鉴别免疫动物还是感染动物，结果易受到结核菌素质量和剂量、结果判定标准及操作方法等因素影响，需4旷72h后观察结果。程振涛等根据牛结核分枝杆菌基因组设计合成引物，建立荧光定量PCR方法，优化反

7、应条件，能有效检测牛结核分枝杆菌目的基因，可对鲜乳样本中牛结核分枝杆菌进行定性和定量检测。目前市面上还没有针对牛结核病的荧光PCR检测试剂盒，但随着市场的需要和科学的发展，该技术有望成为检测牛结核病的一种实用而可靠的手段。6小结与展望各种文献和试验证明，荧光定量PCR技术具有快速、高效、特异性好、灵敏度高、污染小等诸多长处，为动物疫病诊断提供了新的技术手段。目前，仪器价格昂贵、试剂成本高等现实因素限制了该技术在兽陕实验室的普及和应用，但是相信随着PCR仪的更新换代，试剂盒成木不断降低，实时荧光PCR技术将会将得到更为

8、广泛的推广和应用，将更好地服务于动物防疫工作。参考文献[1]花群义，等•应用实时荧光定量TaqManRT-PCR检测口蹄疫病毒[J]・中国兽医学报，2005.25(2):116-119.[2]高正琴，等・TaqManMGB探针实时荧光定量PCR快速检测布鲁氏菌[J].中国人兽共患病学报，2014,27(11):995-1000.[3]唐泰山，等