张艳霏论文8月

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1、分类号学校代码10426密级学号2009050611dk青矗謝技大辱QingdaoUniversityofScience&Technology硕士学位论文MASTERDEGREETHESIS鳗弧菌亚精胺结合蛋白基因的鉴定及功能研究学生：张艳霏指导教师：马翠萍副教授邹玉霞副研究员学科专业：海洋化学专业代码：070702研究方向：微生物与分子生物学2012年4月15EI鳗弧菌亚精胺结合蛋白基因的鉴定及功能研究学位论文完成日期：指导教师签字：答辩委员会成员签字：鳗弧菌亚精胺结合蛋白基因的鉴定及功能研究生物体内普遍存在的多

2、胺转运系统PotABCD运载体由四个功能蛋□组成：PotA是三磷酸腺苗酶，为转运系统提供能量；PotB和PotC可在双层膜上形成转运通道；PotD是一种胞质结合蛋白，有一个多胺识别区域，对亚精胺有较高的亲和性，对腐胺亲和性较低。鳗弧菌(Vibriocmguillarum)M3H1发现了编码亚精胺结合蛋白的三个推定potD基因：potDl、potD2和potD3o为了研究这三个基因在鳗弧菌M3亚精胺转运中起到的作用以及对致病性鳗弧菌M3毒力的影响，本研究利用框内缺失技术构建了poiD】、potD2和皿江>3单基因缺失

3、突变株和多基因缺失突变株，同时利用细菌的接合转移技术，以低拷贝克隆质粒Pmmb207为载体，构建了突变株的互补株。在排除了鳗弧菌自身合成对胞内多胺含量影响的化学定义的最低培养基M9屮，potDl或"/Q3基因的单独缺失或同时缺失突变株屮多胺的含虽与野生型鳗弧菌M3相比明显降低，并且其生长速度也明显下降，说明〃加0/和0加03基因能够参与鳗弧菌M3多胺的转运过程，是鳗弧菌屮亚精胺结合蛋白的编码基因。potDl和〃”£>3基因通过对多胺转运过程的影响间接的影响了鳗弧菌的生氏能力以及对鱼的致病能力基因与和potD3基因之

4、间存在拮抗作用,基因的单独缺失不会影响鳗弧菌胞内多胺的含量，虽然它不参与亚精胺转运蛋白的编码，但是potD2基因能在一定程度上抑制potDl^0potD3基因的表达，所以它的单独缺失或与potDl、potD3的同时缺失能不同程度的改变鳗弧菌的生长能力和毒力等。实时荧光定量PCR的方法进一步的验证了上述基因在突变株屮的表达情况，并确定鳗弧菌性状的改变是由基因表达量的变化引起的。关键词：鳗弧菌亚精胺结合蛋白基因功能鉴定鳗弧菌亚粘胺结合贺口基因的鉴定及功能研究THEIDENTIFICATIONANDFUNCTIONALS

5、TUDYOFSPERMIDINEBINDINGPROTEINGENEINVIBRIOANGUILLARUMABSTRACTThewidespreadpolyaminetransportsystemPotABCDtransporterinvivoiscomposedbythefourfunctionalproteins:PotA,ATPase,providesenergyforthetransportsystem;PotBandPotCcanformtransportchannelsinthedoublemembra

6、ne;PotD,whichisacytoplasmiccombinationproteinwithapolyaminerecognitiondomain,hasahigheraffinityforspermidineandloweraffinityforputrescine.ThreepresumptivepotDgenesthatencodespermidinebindingproteinPotDinVibrioan^uillarumM3:potDl,potD2andpotD3.Inordertostudythe

7、roleofthesethreegenesinVibrioan^uillaritmM3spermidinetransporter,aswellastheimpactonthevirulenceofVibrioemguillarumM3.Weusedthein・framedeletiontechnologytobuildthepotDl,potD2,andpolD3singlegenedeletionmutantsandmulti-genedeletionmutants,andinthesametimewetooka

8、dvantageofbacteriajointstransfertechnology,usinglowcopynumbercloningplasmidPmmb207carrierbuiltacomplementarymutantstrains.Ignoredtheinfluenceofsynthesisprocedureonintracellularpoly