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《幽门螺杆菌耐药率和根除治疗方案的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、总计293名患者入选此项研究（男182例，女111例），患者内镜诊断包括慢性胃炎、消化性溃疡及胃癌。所有患者均签署了知情同意书。1.4H.pylori菌株培养内镜下从快速尿素酶试验阳性患者胃窦部取胃黏膜一块用于H.pylori培养。活检标本的培养使用脑心浸液（BHI）琼脂培养基，培养基中含5%脱纤维羊血。置于37°C微需氧培养箱中培养（85%N2,10%CO2和5%02）o培养岀的细菌经尿素酶试验、过氧化试验、触酶试验和革兰氏染色鉴定为H.pylori后悬浮于含30%甘油的BHI液体中，置于一80°C保存。H.pylori培养基的制
2、备：分别称取19.5gColumbia琼脂和8g脑心浸液加650mL的双蒸水充分混匀，高压灭菌后取出置于42°C水浴锅缓慢降温至42°C,加入33mL的新鲜脱纤维羊血，混匀，铺板，4°C保存备用。对于选择性H.pylori
3、rt
4、体培养基则在加入羊血后加入选择性抗生素混合液3.2mL（Vancomycin,万古霉素：10mg/L；AmphotericinB,两性霉素B：10mg/L；Polymyxin,多粘菌素：2500U/L；Trimethoprim,三甲氧氨节卩密I症：5mg/L；Nalidixicacid,蔡I定酸：1Omg/
5、L）o胃镜活检钳取胃黏膜组织标本后立即放入无菌的生理盐水中，室温4小时内取出，肓接划线接种到含选择性抗生素的固体培养基上，将培养平板置于37°C、5%氧气的微需氧环境中进行培养。接种4・5天后观察分离效果，阳性者进行传代扩菌。并通过观察菌落形态、Gram氏染色镜检、尿素酶和过氧化氢酶试验鉴定H.pylorioH.pylori菌落在固体培养基上呈透明、针尖样；镜下观察为Gram氏染色阴性，呈紫红色，海鸥状、马蹄状或螺旋状；取少量H.pylori置于尿素酶板可见尿素酶板由原来的橘黄色变成深红色；过氧化氢酶试验阳性。将扩增后的菌株悬浮于蛋
6、口月东、胰蛋口月东及甘油为主要成分的冻存液中，・80°C低温保存。-80°C冻存的H.pylori取出后，室温溶解，直接接种到无抗生素的H.pylori固体培养基中，培养条件同上，培养3天传代一次，细菌传代3・4天后进行试验。共复苏出293株H.pylori临床菌株用于试验，其中包括2000年分离保存的58株，2005年的100株和2009年的135株。以ATCC43504标准菌株作为质控对照菌。二研究方法2.1琼脂稀释试验甲硝卩坐、克拉霉素、阿莫西林、左氧氟沙星、四环素及咲喃卩坐酮的最低抑菌浓度使用琼脂稀释法检测。2.1.1抗生素
7、溶液的配制(1)O.1M磷酸盐缓冲液(pH6.0)的配制：称取磷酸二氢钾6.085g,加蒸憾水至500mL,混匀，使之完全溶解；再称取NaHPO412H2O3.581g加蒸憾水至100mL,溶解，混匀;取磷酸二氢钾溶液440mL,NaHPO412H2O溶液60mL,置于500mL锥形瓶内混匀，调节pH=6.0,高压灭菌后备用。(2)甲硝哩和左氧氟沙星用蒸馆水溶解，终浓度分别为5mg/mL和10mg/mL；四环素用0.1M磷酸盐缓冲液(pH6.0)溶解，终浓度分别为lmg/mL；克拉霉素用丙酮和蒸憾水(1:1)溶解，先加丙酮，再加蒸憾
8、水，终浓度为2mg/mLo以上四种抗生素可提前配制，置于・20°C保存。阿莫西林用0.1M磷酸盐缓冲液(pH6.0)溶解，试验当天配制。咲喃哇酮用N,N・二甲基甲酰胺(DMF)和蒸憾水(1:1)溶解，先加DMF将咲喃卩坐酮完全溶解后，再加蒸谓水，试验当天配制。(3)各抗牛素需配置的浓度(ug/mL)及溶剂如下表1和表2所示：表1各抗生素琼脂稀释浓度Table1.DilutestrengthofantibioticsusedinthisstudyAntibioticDilutestrength(ug/mL)Met12864321684
9、210.50.250.125Cla64321684210.50.250.1250.0625Lev64321684210.50.250.1250.0625Tet321684210.50.250.1250.06250.03125Amo1684210.50.250.1250.06250.03125Fur1684210.50.250.1250.06250.03125表2抗生素生产厂家及溶剂Table2.Antibioticsusedinthisstudy抗生素名称生产厂家溶剂甲硝卩坐(Met)武汉制药有限公司提供蒸馆水克拉霉素(Cla)丽珠
10、制药有限公司提供丙酮左氧氟沙星(Lev)丽珠制药有限公司提供蒸惚水四环素(Tct)购于SIGMA公司0.1M磷酸盐缓冲液(pH6.0)阿莫西林(Amo)昆明贝克诺顿制药有限公司提供磷酸盐缓冲液(pH6.0)咲喃卩坐酮(Fm)深圳江门制
