微生物鉴定技术在药品检验及监管中的应用

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1、上海市食品药品检验所2010年5月27徐伟东微生物鉴定技术在药品检验和监管中的应用微生物鉴定技术平台的建设二样品微生物的鉴定及同源性分析三微生物实验室能力建设微生物新技术的应用四微生物污染监管方式的思考五背景介绍一一、背景介绍在1993-1998年间，美国FDA报告的由微生物污染引起的召回案件达到1370件，占所有产品召回案件的36%我国药品微生物污染的调查数据较少，但微生物污染仍居首位，近期披露的黑龙江完达山刺五加注射液受微生物污染的问题，已经造成了十分严重后果和无法挽回的损失。药品安全管理仍存在监管漏洞，造成定性难、溯源难、应变慢等问题，以及新的致病微生物或变异体

2、的出现，导致药品受到微生物污染我国各大城市不断承办国际大型体育赛事和国际会议尤其是2010年在我国召开的上海世界博览会，也进一步增强了对药品的监督管理水平的要求。对微生物分类水平较低，只能鉴定到“属”，鉴定微生物种类有限传统微生物鉴定方法的局限分子方法分子生物学技术研究的是微生物DNA序列信息，常用于细菌分类的16SrDNA也有1500个碱基，每个碱基位置由ATGC四种核苷酸中的一种组成，多样性可达种可能（约）10900。新版的《伯杰氏系统细菌学手册》微生物DNA变异信息为主传统方法人类已知的土壤微生物已达到10万种现在常用的微生物鉴定用生化反应只有20多种，实际经过

3、研究形成一致标准的、有意义的生化鉴定结果仅2000多种。微生物生化鉴定金标准的API鉴定系统——仅能鉴定550种细菌通过碳源利用进行微生物鉴定的Biolog系统也仅能鉴定2000种微生物微生物变异能力强，生化反应准确度不高，错检漏检现象普遍传统微生物鉴定方法的局限生化反应鉴定主要是利用不同微生物自身所特有的不同酶系统，根据微生物利用分解底物的种类和营养来源进行分类鉴定。在大多数情况下，同“属”微生物的酶系统基本相同，可以达到鉴定的目的微生物DNA突变能力强，如果这些突变点涉及到微生物酶系统的表达，就会造成酶活性降低甚至酶缺陷，导致鉴定失败在现行国家标准中，只有血浆凝固

4、酶阳性反应才会被确证为金黄色葡萄球菌阳性，阴性反应的微生物则被作为无害菌处理。然而，近几年引起高度关注的血浆凝固酶阴性金黄色葡萄球菌的流行使得金黄色葡萄球菌被漏检，血浆凝固酶阴性金黄色葡萄球菌往往含有肠毒素和其他毒素，是引起医院感染、社区食物中毒的重要污染源。不能对微生物污染进行准确溯源分析传统微生物鉴定方法的局限在进化过程中生物DNA分子会形成大量DNA多态性区域和非编码DNA序列。不会造成生物种属归类争议也不会造成任何形态上或酶系统表达的改变通过生化鉴定方法无法对这类变化进行有效的分析DNA位点变化却包含大量重要的微生物所独有的进化信息，可以与其他来源的同种微生物

5、相区别，也是微生物种内差异的来源如常用于真菌种类鉴定的ITS基因ITS片段能保持相对稳定的变异频率亲缘关系非常接近的2个种都能在ITS序列上表现出差异，显示最近的进化特征微生物鉴定技术平台的建设二样品微生物的鉴定及同源性分析三微生物实验室能力建设微生物新技术的应用四微生物污染监管方式的思考五背景介绍一2.1技术手段2.2方法比较2.1技术手段2.2方法比较革兰氏染色镜鉴按照标准进行传统的生化反应鉴定API试剂条菌鉴定国际金标准半自动细菌鉴定仪（ATBExpression）全自动细菌鉴定仪（VITEK2）微生物鉴定手段MiniVIDAS筛选系统免疫凝集/免疫沉淀实验微生

6、物检测手段荧光定量PCR(BAX)色谱、光谱分析技术分子生物学技术传统筛选方法2.1技术手段GenBankPCR基因分型分子杂交阳性菌分子水平上的鉴定12341.形态学鉴定3.核糖体水平上的鉴定APIVITEK16SrDNA序列分析分子杂交（DupontRiboPrinter）2.生化鉴定傅里叶红外光谱Rep-PCR(DiversiLab)4.全基因组水平上的鉴定5.脉冲场电泳技术(PFGE),多位点序列分析(MLST),多位点重复串联序列分析(MLVA),随机扩增多态性分析技术（RAPD)API试剂条——菌鉴定国际金标准无需专用仪器，标准化手工方法完成细菌的生化鉴定

7、，为低成本替代传统手工细菌生化鉴定的最佳产品。特点：完整的鉴定谱：15种试条，可鉴定的细菌多于550种简单方便：标准化方法，成本低廉，判读结果简单快速结果：4-24小时。半自动细菌鉴定仪（ATBExpression）检测项目：可鉴定由环境、原料及制成品分离出的菌种和药敏试验（包括：肠杆菌、非发酵G（-）杆菌、葡萄球菌、链球菌、酵母菌、厌氧菌）。可鉴定770种细菌和分析近80种抗生素药敏实验。原理：鉴定试条包含风干底物的反应孔，经标准浊度的菌液活化，于指定温度培养4小时/24小时后即可。计算机根据阅读器检测到的结果自动调用相应试剂条数据库，得出生化/同