粘质沙雷氏菌脂多糖的提取

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1、粘质沙雷氏菌脂多糖的提取实验目的1、了解脂多糖（LPS）的生理生化作用及其制品的应用；2、掌握从粘质沙雷氏菌中提出LPS的主要方法。实验原理内毒素（endotoxin，ET）是存在于革兰氏阴性细菌细胞壁外膜中的一类脂多糖物质。机体应用小剂量内毒素，能表达出显著的有益作用，是一种有效的保护性抗原，临床上用于各种恶性肿瘤患者用因放疗、化疗所引起的白细胞减少症，以及由白细胞减少继发的慢性乙型肝炎，多发的急慢性感染等。脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)是位于革兰氏阴性细菌细胞壁最外层的一层较厚（8-10nm）

2、的类脂多糖类物质。它是革兰氏阴性细菌所特有的结构，是革兰氏阴性细菌细胞壁的重要组成部分。它还是一种非常重要而被广泛研究的免疫增强剂，同时一些脂多糖是致病性的内毒素。另外在血清分型中脂多糖也有重要作用。LPS及其类脂A对机体能发挥广泛的生物学作用。LPS一方面可视为革兰氏阴性菌的致病因子，因而在革兰氏阴性菌感染的发病机理中起着十分重要的作用，另一方面LPS对机体亦可表现出显著的有益作用，如抗肿瘤作用，增强机体特异性抵抗力等。所有的内毒素尽管来源不同，但均具有相似的生理作用。粘质沙雷氏菌（Serratiamarcescens）

3、曾称灵杆菌，它属于真细菌纲，真细菌目，肠杆菌科，沙雷氏菌属。它是细菌中最小者，细胞杆状或球状，单个存在或排列成短链，每链有3~6个细胞，能运动，有4条或更多鞭毛，周身鞭毛，无荚膜，无芽孢。粘质沙雷氏菌为腐生菌，在自然界中分布很广，分布于土壤、水和食品中，也存在于人的呼吸道、肠道和粪便中。所以该菌可自土壤、水，人和动物的粪便中分离得到。该菌属长期以来认为对人体无害，但近来发现粘质沙雷氏菌是条件致病菌，可引起肺炎、泌尿道感染、呼吸道感染、败血症以及外科术后创伤感染，是医源性感染的重要条件致病菌。约半数菌株能产生红色的灵菌素，多

4、次传代后产生色素的能力减弱，甚至消失。革兰氏染色呈阴性。灵菌素是由粘质沙雷氏菌菌体中提取的脂多糖，能激活脑下垂体——肾上腺皮质系统，调整机体内部环境与功能，增强机体对外界环境变化的适应能力，刺激机体产生体液抗体，使白细胞总数增加，吞噬功能加强，激活机体防御系统，抗御病原微生物及病毒的侵袭。同时它还具有抗菌抑癌，提高免疫力等生理活性功能。目前从粘质沙雷氏菌中提取脂多糖的方法有很多，主要有三氯乙酸-乙醇冷提法、盐析法、热水提取法和热酚水法。（1）三氯乙酸-乙醇冷提法。粘质沙雷氏菌深层发酵获得的菌体，用生理盐水洗后，用0.25M

5、三氯乙酸浸提（1：3v/v）0℃搅拌2d，离心，菌体再用三氯乙酸浸提2次。浸提液合并通过0.5cm高的硅藻土抽滤，得透明的乳白色液体，在3—6℃时加入3.3%体积醋酸钠饱和的乙醇溶液，然后加入6—8倍体积的冷乙醇，使灵菌素沉淀，沉淀物溶在0.25M三氯乙酸，按上法反复沉淀3次，透析、冷冻干燥的灵菌素冻干品。（2）盐析法。粘质沙雷氏菌深层发酵获得的菌体，用生理盐水洗后，用0.2M三氯乙酸浸提（1：3v/v）0℃搅拌2天，离心，菌体再用三氯乙酸浸提2次。浸提液中加入固体硫酸铵使之呈50%饱和度，如有沉淀离心弃去，上清液中加硫酸

6、铵至饱和，室温放置24h，发生沉淀[如不发生沉淀，需加入2倍体积的丙酮：乙醇：乙醚（2：2：0.25），离心分成溶剂层和水层，水层继续使用上层溶剂混合物处理2—3次，直至溶液中乳白色消失为止]。收集沉淀，溶于水中，通过强酸和强碱性离子交换树脂除盐，流出液冷冻干燥，得灵菌素冻干制品。（3）热水提取法。菌体用PH3.5稀醋酸溶液回流提取，提取液用Sevag法除去蛋白质，水层加乙醇，离心收集沉淀，透析，透析液中加NaCl及乙醇，离心分离沉淀得白色粉末粗制品。将它溶于水中，加乙醇（一倍体积）除去沉淀，再加一倍体积乙醇，收集沉淀，透

7、析，冻干得粘质赛氏甘露聚糖（Serratimann）。上清液中加入NaCl离心收集沉淀，透析，脱盐，冻干得粘质赛氏杆菌素（Serratigen）。（4）热酚水法。本次试验所采用的方法，相比其他三种方法，具有操作相对简便，提取效果好的优势。三、仪器和药品⒈药品牛肉提取物、蛋白胨、NaCl、琼脂、蒸馏水、生理盐水、苯酚、无水乙醇、NaHCO3、EDTA。⒉仪器广泛pH试纸、塑料布、透析袋、。三角瓶（50mL、250mL）、离心管、玻璃棒、烧杯、可调式移液器（1000-1000μL、1-5mL）、可调式移液器枪头。恒温培养箱、离

8、心机、天平、摇床、水浴箱、冻干机、湿热灭菌锅。四、实验步骤⒈菌种培养⑴斜面培养基培养。将营养肉汁琼脂培养基[（g/L）：（蛋白胨10.0，牛肉提取物3.0，NaCl5.0，琼脂15.0，PH值7.0左右）]制作成斜面培养基，将菌种接种在斜面培养基上，28℃恒温培养24～48h。⑵发酵培养基培养。制作营养