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1、基因枪介导GmDREB3基因转化小麦幼胚愈伤组织的研究崔志钢*,陈耀锋'，周文丽'，杨梅徐东北1（1西北农林科技大学农学院，陕西杨凌712100）［摘要］为了提高小麦的抗逆性，本实验通过基因枪共转化途径，将6加〃他汲?基因和抗除草剂b吐基因通过共转化途径同时导入小麦品种小偃22。实验结果表明小麦幼胚通过9天的愈伤组织诱导，基因枪轰击金粉用量为60pg/枪，分別添加NM和KTlmg/L的MS培养基，这一组合获得抗性再生植株频率最高。并对再生植株进行PCR检测表明，目的基因已整合到小麦染色体组。［关键词］基因枪;愈伤组织;恢复培养;筛选分化;再生植株［中图分类号］［文献标识码］A［文章编号］S
2、tudiesoftransformationoftheGmDREB3geneintoImmatureEmbryosofWheatbyParticleBombardmentCUIZhigang,CHENYaoFeng,ZHOUWenLi,YANGMei,XUDongBei（1CollegeofAgronomy,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China）Abstract:Keywords:genegun；callus；recoverculture：screeninganddifferentiation；regenerationpla
3、nt小麦转基因研究始于20
4、比纪90年代初期，近些年来,大量有关转基因科研工作的开展,使小麦转基因存了迅速的发展。但由于小麦转化研究起步较晚，普遍存在转化频率低的现象。转化系统还有待进一步完善，因此有必要对转化过程屮的诸多影响因索进行研究。从而提高小麦转化频率，加快转基因小麦的应用与产业化进程。本研究对基因枪法转化小麦中的愈伤组织诱导时间，金粉用虽，筛选分化培养革等影响因索进行了研究，为完善小麦转化系统提供一定的依据。1材料和方法1.1实验材料及培养基1.1.1受体材料以小麦幼胚愈伤组织为基因枪轰击的受体材料。小麦材料为西北农林科技人学细胞工程实验室试验田种植的黄淮麦区优良小麦甜种係）小偃
5、22O1.1.2载体和引物携带GmDREB3基因的植物表达载体质粒为pKS,携带筛选标记抗除草剂(hr)基因的质粒载体为PAHC20,由北京农科院马有志老师提供。设计的特异引物由上海牛物工程技术服务有限公司合成，序列如下：5’弓I物：CAGAGGAGCATAGCGATTCCAAGTA3’引物：TCCCGTAATCGGATGCGTAACCACT1.1.3培养基愈伤诱导培养基：MS+2,4-D2.Omg/L+蔗糖30g/L+Ag5.0g/L(pH5.8);高渗培养基:MS+山梨醇0.2mol/L+甘露醇0.加ol/L+Ag6.0g/L(pH5.8);恢复培养基：SD2+2,42D2.0mg/L
6、+蔗糖30g/L+Ag6・0g/L(p115.8);筛选分化培养基:①MS+NAAO.1mg/L+KT1mg/L+Bia1aphos2mg/L+蔗糖30g/L+Ag6.0g/L(pH5.8)；01/2MS+NAA0.5mg/L+KTl.Omg/L+Bialaphos2mg/L+蔗糖30g/L+Ag6.0g/L(pH5.8)；®MS+NAAO.1mg/L+KT3mg/L+Bialaphos2mg/L+蔗糖30g/L+Ag6.0g/L(pH5.8)；④1/2MS-IKT1.0mg/L+NAA1.Omg/L+Bialaphos加g/L+蔗糖30“L+Ag6.0g/L(p115.8)；®MS+KT
7、lmg/L+Bia1aphos2mg/L+蔗糖30g/L+Ag6.0g/L(p115.8)©生根培养基：1/2MS+NAA0.5mg/L+Bialaphos2mg/L+多效呼4mg/L+蔗糖30g/L+Ag6.0g/L(pH5.8)；壮苗培养基:1/2MS++Bialaphos2mg/L+多效哇4mg/L+蔗糖30g/L+Ag6.0g/所有培养基均采用高温高压灭菌，筛选剂采用过滤灭菌,培养基冷却至50°C-60°C左右时加入。1.2方法1.2.1幼胚愈伤组织诱导于山间剪収授粉14左右的麦穗，剥取幼嫩种子，于超净工作台内用体积分数75%的酒精表面消毒30s,再用1g/L的升汞灭菌8〜10mi
8、n,灭菌过程中不停的摇动麦粒,无菌水冲洗5次，剥取幼胚，平面向上接种到幼胚愈伤组织诱导培养基上,26°C下黑暗培养，诱导时间分别为：3d,6d,9d,12do1.2.2高渗处理小麦愈伤组织在肓径9cm的培养祖上铺一薄层高渗培养基，将幼胚愈伤组织按原生长方向紧密摆放于培养皿中央总径3cm范围之内，在轰击前6h对幼胚愈伤组织进行髙渗处理。1.2.3基因枪转化采用PDS-1000/He基因枪(bia-rod公司生产)轰击小麦幼
