半数致死量的测定

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1、Reed-Muench法物受到病毒感染后，体内产生特异性中和抗体，并与相应的病毒粒子呈现特异性结合，因而阻止病毒对敏感细胞的吸附，或抑制其侵入，使病毒失去感染能力。中和试验(NeutralizationTest)是以测定病毒的感染力为基础，以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据，来判定免疫血清中和病毒的能力。中和试验常用的有两种方法：一种是固定病毒量与等量系列倍比稀释的血清混合，另一种是固定血清用量与等量系列对数稀释(即十倍递次稀释)的病毒混合；然后把血清－病毒混合物置适当的条件下感作一定

2、时间后，接种于敏感细胞、鸡胚或动物，测定血清阻止病毒感染宿主的能力及其效价。如果接种血清病毒混合物的宿主与对照(指仅接种病毒的宿主)一样地出现病变或死亡，说明血清中没有相应的中和抗体。中和反应不仅能定性而且能定量，故中和试验可应用于：1.病毒株的种型鉴定：中和试验具有较高的特异性，利用同一病毒的不同型的毒株或不同型标准血清，即可测知相应血清或病毒的型，所以，中和试验不但可以定属而且可以定型。2.测定血清抗体效价：中和抗体出现于病毒感染的较早期，在体内的维持时间较长。动物体内中和抗体水平的高低，可

3、显示动物抵抗病毒的能力。3.分析病毒的抗原性。毒素和抗毒素亦可进行中和试验，其方法与病毒中和试验基本相同。用组织细胞进行中和试验，有常量法和微量法两种，因微量法简便，结果易于判定，适于作大批量试验，所以近来得到了广泛的应用。(一)定血清－稀释病毒法(病毒中和试验)1.病毒毒价的测定　毒价单位：衡量病毒毒价(毒力)的单位过去多用最小致死量(MLD)，即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致全组试验动物死亡的最小剂量。但由于剂量的递增与死亡率递增不呈线性关系，在越接近100％死亡时

4、，对剂量的递增越不敏感。而一般在死亡率越接近50％时，对剂量的变化越敏感，故现多改用半数致死量(LD50)作为毒价测定单位，即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致半数试验动物死亡的剂量。用鸡胚测定时，毒价单位为鸡胚半数致死量(ELD50)或鸡胚半数感染量(EID50)。用细胞培养测定时，用组织细胞半数感染量(TCID50)。在测定疫苗的免疫性能时，则用半数免疫量(IMD50)或半数保护量(PD50)。(1)LD50的测定(以流行性乙型脑炎病毒为例)。测定方法：将接种病毒，并已

5、发病濒死的小鼠，无菌法取脑组织，称重、加稀释液充分研磨，配制成10-1悬液，3000r/min离心20分钟，取上清液，以10倍递次稀释成10-1、10-2、10-3……10-9，每个稀释度分别接种5只小鼠，每只脑内注射0.03ml，逐日观察记录各组的死亡数。表2-24　LD50的计算（接种剂量为0.03ml）病毒稀释度接种鼠数活鼠数死鼠数积累总计死亡比死亡率(%)活鼠死亡10-450501515/1510010-550501010/1010010-6514155/68310-7541511/61

6、710-85501000/10010-95501500/150LD50的计算：按Reed和Muench氏法计算。高于50%的死亡分数-50%　　　　　　　　83%-50%距离比例=────────────────────=─────=0.5高于50%的死亡百分数-低于50%的死亡百分数　　　83%－17%LD50的对数=高于50%病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数本例高于50%病毒稀释度的对数－6，距离比例为0.5，称释系数的对数为－1。代入上式：LgLD=-6+0.5×(－1)=－6.

7、5则LD50=10-6.5，0.03ml，即该病毒作10-6.5稀释，接种0.03ml能使半数小鼠发生死亡。注意：稀释血清法中和试验，计算TCID50或LD50，MID50时，计算公式应改为：TCID50的对数=高于50%血清稀释度的对数－距离比例×稀释系数的对数。如按Karber氏法计算，其公式为：IgLD50（或TCID50）=L+d(S－0.5)L为病毒最低稀释度的对数，d为组距，即稀释系数，S为死亡比值的和。本例L=－4，d=－1，S=1+1+5/6+1/6=3IgLD50=－4+(－1

8、)×(3－0.5)=－6.5则　　　　　　　LD50=10-6.5，0.03ml注意：用本法计算稀释血清中和试验中和效价时，S应为保护比值之和2)EID50的测定（以新城疫病毒为例）　将新鲜病毒液体10倍递次稀释法释成10-1、10-2、10-3……10-9不同稀释度，分别接种9-10日龄鸡胚尿囊腔，鸡胚必须来自健康母鸡，并且没有新城疫抗体。每只鸡胚接种0.2ml，每个稀释度接种6只鸡胚为一组，以石蜡封口，置37-38℃培养，每天照蛋，24h之内死亡的鸡胚弃掉，24h之后死亡的鸡胚置4℃保存。连