贝毒结合蛋白的分离纯化及其降低麻痹性贝毒毒性的研究

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1、分类号：P745密级：秘密2014.06至2015.06UDC：615.9学号：2111104312广东海洋大学硕士学位论文贝毒结合蛋白的分离纯化及其降低麻痹性贝毒毒性的研究陈晓指导教师：林华娟副教授申请学位类别：农学硕士专业名称：食品科学研究方向：食品加工与保藏学院名称：食品科技学院中国·湛江2014年6月贝毒结合蛋白的分离纯化及其降低麻痹性贝毒毒性的研究摘要麻痹性贝毒(paralyticshellfishpoisoning，PSP)是一类阻断神经细胞钠离子通道，对人体神经系统产生麻痹作用的海洋生物毒素。该毒素对人体毒性极强

2、，至今仍没有特效解毒药，迫切需要研发抗麻痹性贝毒的特效解毒药。本研究在前期研究的基础上，对三种麻痹性贝毒亲和蛋白纯化方法效果进行了比较，对麻痹性贝毒亲和蛋白的理化性质、稳定性进行了探究，最后通过结合试验对亲和合蛋白与各类毒素的结合规律进行了研究。旨在为研发特效解毒药及钝齿短浆蟹抗PSP毒性机理的研究提供科学理论依据。本文主要从以下几个方面进行了探索研究。1.通过探讨比较硫酸铵分级沉淀法、凝胶柱层析和亲和层析三种方法对钝齿短浆蟹淋巴液中的毒素亲和蛋白的分离纯化效果，得到麻痹性贝毒亲和蛋白最佳分离纯化方法。实验结果显示以AF-Ep

3、oxy-650M树脂为媒介的亲和层析法能够最有效的将毒素亲和蛋白分离开来，纯化得到的蛋白虽不是绝对单一蛋白质，仍然具有较高的毒素中和效果。2.以HPLC为检测手段，对前期分离获得的毒素亲和蛋白的理化性质及稳定性进行分析研究。实验结果表明，将PSP毒素与亲和蛋白在pH7.15左右、4℃条件下结合反应1h，能够达到最佳结合效果；二价金属离子MgCl2、CaCl2对贝毒亲和蛋白与PSP毒素的结合效果具有明显的抑制作用.在影响亲和蛋白稳定性因素中，温度度越高，越不利于亲和蛋白活性的保持，4℃存放，其对STXs、GTXs毒素结合率最高；

4、不同变性对剂毒素亲和蛋白的活力具有不同的破坏作用，1%SDS对毒素亲和蛋白活性的破坏力最大，其次是5%DTT和3M盐酸胍。3.利用AOAC小鼠生物法和高效液相色谱(HPLC)两种检测方法，对PSP毒素亲和蛋白进行毒素结合动力学分析。当不同浓度的亲和蛋白与PSP结合时，但毒素结合量随着蛋白浓度升高逐渐升高。高浓度PSP毒素亲和蛋白的存在大大延长了小鼠致死时间。关键词：钝齿短浆蟹，淋巴液，麻痹性贝毒，中和效果，亲和蛋白IIIPSPBindingProtein:It’sPurificationAndNeutralizationtoP

5、aralyticShellfishPoisoning(PSP)ToxicityAbstractParalyticshellfishpoisoning(PSP)isakindofmarinebiotoxin,whichcanbolcksodiumchannelsinthenervecellandcauseparalysisofhumannervesystem.PSPtoxinscanleadtopoisoningdeathofhumanityafteratethetaintedshellfish.Butfornowthereis

6、nospecificantidotetoagainstPSP.Basedonpreviousresearch,takingshorecrabThalamitacrenatainhabitednearZhanjiangleizhoupeninsulaastheresearchobjects,analyzeandcomparethreepurifyingmethodsofPSPbindingprotein(PSPBP),furtherexpounditsphysicalandchemicalproperties,stablitya

7、ndneutralizationeffecttoPSP.TheconclusionwillprovidescientifictheoreticalbasisforthePSPandtheresearchofantidotes.Thisarticlemainlystudiedfromthefollowingseveralaspects.1.WegetthebestpurificationmethodofthePSPBPbycomparingtheammoniumsulfateprecipitation,gelcolumnchro

8、matographyandaffinitychromatography.TheseresultsindicatethatUsingtheaffinityresinAF-Epoxy-650MtopurifyPSPBPcanattainthebestpurifyingeffect