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1、麻痹性贝毒的分析方法研究进展论文.freelethods,andchemicaltestanalysismethodsenteachothermarized.Neethodologyethod;biologicalmethod;chemicalmethod随着社会的发展,人们的生活质量渐渐提高,各种海产贝类食品越来越多地进入了寻常百姓家的餐桌,并且越来越受到欢迎。然而人们在享受美味的同时,却不知道有些贝类是有毒的,使近年来贝类中毒事件频繁发生1-3。海洋中的贝类有扇贝、蛤蜊、贻贝等,它们均以生活在海水中的单细胞藻类为食物。但有些单细胞藻类是有毒的4,.f
2、reelists,AOAC)的标准方法7。由于PSP毒素在pH值3~4时最稳定8;提取物中大量的盐,主要是Na+会降低生物测试的毒性值9,因此在试验中要严格控制毒素提取溶液的pH值和盐的含量。牡蛎样品中积累的锌元素也会对小鼠有致死作用,导致测试分析结果偏高10。同时由于不同品系的小白鼠对PSP的敏感性差异较大,故标准方法中选用ICR品系小鼠为测试动物,以15min内将1只体重为20g的ICR品系的雄性小鼠杀死的毒性定义为1鼠单位(MU),1MU=0.18pgSTX。1.2其他生物体内测试法家蝇生物测试法分析PSP:将PSP的酸性提取液注入家蝇的体内,观察
3、家蝇的活动特征,并记录死亡时间。分析方法与小鼠生物测试很相近。用该方法检测贝样中PSP的最低限为20pgSTXeq/100g贝组织11。但由于该方法需要借助显微镜注射样品,操作困难,没有被推广使用。蝗虫生物测试法分析PSP:沿蝗虫的腹部在体节之间注射10μL的测试样品,观察并记录一定时间内被麻痹蝗虫的百分率。结果发现,该方法与小鼠生物测试和液相色谱等分析结果基本一致12。1.3细胞毒性测试法细胞毒性测试法也叫组织培养分析法,该方法测试PSP毒素的原理是箭毒、藜芦定对神经母细胞瘤Na+通道具有协同的开放作用,可增进Na+向细胞内的流动,从而引起细胞内外渗透
4、压的改变,使细胞形态肿胀甚至导致细胞裂解死亡。作为Na+通道阻断剂的PSP毒素可拮抗这种细胞肿胀作用,并且拮抗程度与毒素的剂量具有很好的相关性。Jellett等13应用这一原理建立了测试PSP的方法,主要步骤是将分离的小脑神经细胞悬浮于一定的培养基中,该细胞一旦在培养基中分化,能够表达对PSP敏感的电压依赖式Na+通道。用一定浓度的藜芦定处理,向培养基中分别加入不同浓度的PSP提取液或不同稀释度的标准毒素,24h后用二乙酸荧光素和嗅化乙锭等荧光剂处理细胞。在荧光灯下,存活的神经细胞呈现绿色,而死亡细胞的核呈现红色。根据存活细胞占总细胞的百分率计算测试样品
5、中的毒素含量。该方法的最低检出限约为40μgSTX/100g组织。目前,由JellettBiotekLtd.公司建立的用于PSP检测的神经细胞生物分析装(MISTTM),市场上已有销售,并且使用该装置测试贝类中的PSP得到了很好的结果。该装置的最低检出限为2μgSTXeq/100g贝肉,灵敏度远远高于小鼠生物测试法。但由于其组织培养期较长,成本相对较高,没有得到普遍推广。1.4免疫测试分析法目前,利用免疫测试分析法检测STX毒素的试剂盒(RIDASCREENR-Biopharm,Darmstad,Germany)已经上市,但还未经美国分析化学家协会(AO
6、AC)确认为标准测试方法。其主要缺点是其他PSP毒素之间的交叉反应难以避免。由JelletBiotekLtd.公司开发的基于侧向流免疫色谱分析PSP毒素的MIST试剂盒,能够在20min内完成定盆分析,可以作为排除阴性样品的预扫描手段14。只需要比较测试色带上2条线的颜色即可,和pH试纸的使用一样简便。每一种PSP毒素类型在管理标准附近都能够检测。但由于不同种PSP毒素对抗体混合物的亲和力有较大的差异,不同毒素组成的样品测量结果波动较大,也难以对样品进行准确定量。1.5放射受体分析法对于PSP毒素的分析,人们建立了放射受体分析法15,其主要原理是:取大鼠
7、大脑细胞膜上的Na+通道受体固定在微滴板表面,通过待测样品和氛标记的标准STX(3H-STX)与受体的竞争性结合,来测定样品中PSP毒素的毒性。该方法对PSP毒素的敏感性极高,检出限达4ngSTXeq/min。2化学测试方法2.1电泳技术测试法2.1.1平板电泳法。对于PSP毒素的检测,人们使用凝胶和纸电泳技术建立了多种分离检测方法16。该方法通常使用过氧化氢显色,用紫外灯检测,能够快速检测一些样品,但其对样品是无法定量的。后来有人使用扫描荧光检测器进行检测,提高了这种方法的灵敏度17。2.1.2毛细管电泳法。毛细管电泳(Capillaryelectro
8、phoresis,CE)是一种相对较新的技术,在生物毒素的分析方面将会有很广泛的
