基因工程的原理和技术emma

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1、基因工程操作的基本步骤获取目的基因形成重组DNA分子将重组DNA分子导入受体细胞4.筛选含有目的基因的受体细胞5.目的基因的表达基因工程基本要素：工具酶、目的基因、载体、宿主（受体）细胞剪切拼接导入表达第一章基因工程1.2.基因工程的原理和技术有关生物：抗逆性、优良品质、生物药物保健品、毒物降解、工业生产所需用酶的基因。获取目的基因：自然界人工第一步：获取目的基因（人们感兴趣的基因）主要是编码蛋白质的基因第一步：获取目的基因目的基因的获取途径：（1）目的基因的序列已知:化学合成法逆转录法逆推法逆转录法AUCGUAA目的基因的信使RNA逆转录酶TAGCAT

2、T单链DNA酶合成TAGCATTATCGTAA双链DNA目的基因PCR蛋白质的氨基酸序列推测信使RNA核苷酸序列碱基互补配对推测结构基因的核苷酸序列化学方法合成目的基因人的血红蛋白基因人的胰岛素基因逆推法：根据已知氨基酸序列人工合成PCR，全称聚合酶链式反应，是在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。（3）PCR技术(目的序列已知情况下)P7课外读循环变性退火延伸模板、引物原料、酶目的基因的扩增呈指数形式扩增（2n）优点:可以获得大量的目的基因。思考？1个DNA分子进行PCR扩增,循环4次，理论上至少需要几个引物？2×（2n-1）(n为循环次数)（2

3、4-1）×2=30PCR技术扩增与DNA复制的比较DNA复制PCR技术场所原理条件解旋方式酶特点结果碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高温下变性解旋解旋酶催化解旋半保留复制、边解旋边复制半保留复制、全解旋再复制体外复制主要在细胞核内大量的DNA片段形成整个DNA分子热稳定的DNA聚合酶DNA聚合酶、解旋酶（2）目的基因的序列未知:从基因文库中获取基因文库的构建将供体生物细胞中的DNA酶切为许多片段，再用运载体分别将这些片段运载到受体细胞中。许多细胞一起包含了该生物全部基因组序列，这样一个

4、集合体叫做基因文库。鸟枪法：散弹射击法最大的缺点：带有很大的盲目性，工作量大，成功率低。某生物体内全部DNA许多DNA片段受体菌群体限制酶与载体连接导入基因组文库某种生物某个时期的mRNAcDNA反转录酶受体菌群体部分基因文库（cDNA文库）基因文库与载体连接导入质粒DNA分子限制酶处理两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种一个切口两个黏性末端第二步：形成重组DNA分子（核心）目的基因与运载体结合的结果可能有几种情况？载体-载体连接物目的基因-载体连接物（重组DNA）目的基因-目的基因连接物第三步：将目的基因导入受体细胞1、常用

5、的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、农杆菌、酵母菌和动植物细胞等细菌质粒————细菌酵母质粒————酵母菌噬菌体————细菌动物病毒————动物细胞植物病毒————植物细胞常用受体细胞常用载体思考:为什么常用细菌和酵母菌作受体细胞？繁殖快、单细胞、遗传物质相对少（1）将目的基因导入微生物细胞（最常用大肠杆菌）受体细胞：细菌CaCl2细胞壁的通透性增大重组质粒进入受体细胞目的基因随受体细胞的繁殖而复制2.导入过程Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞感受态细胞吸收DNA表达载体与感受态细胞混合（2）将目的基因导入植物细胞－双子叶植物农杆菌转化法2.导入过程①农杆菌特点

6、：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。②原理：Ti质粒上的T---DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。P9（3）将目的基因导入植物细胞－单子叶植物基本原理：通过动力系统将带有目的基因的金属颗粒（金粒或钨粒），以一定的速度射进植物细胞。具有一次处理多个细胞的优点，但转化效率较低。基因枪法2.导入过程（4）将目的基因导入植物细胞主要原理：授粉后使外源DNA沿着形成的花粉管通道，进入并整合到受精卵或早期胚胎细胞的基因组中。可以应用于任何开花植物。花粉管通道法2.导入过程特点:十分简便经济目的基因表达载体体外显微注

7、射入受精卵受体细胞？显微注射技术（5）将目的基因导入动物细胞2.导入过程导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少怎样筛选？AmprTetr氨苄青霉素抗性基因四环素抗性基因目的基因插入四环素抗性基因中将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素的培养基上然后将菌落平移按到含四环素的培养基上培养第四步：筛选含有目的基因的受体细胞“选择培养基”未导入①导入普通质粒②重组质粒③转基因生物的DNA探针15N15N14N14N基因探针：放射性同位素等标记的DNA分子方法——DNA分子杂交技术变性变性怎样筛选？第四步：筛选含有目的基因

8、的受体细胞分子水平：变性方法——分子杂交技术（2）检测目的基因是否转录出了mRN