荧光定量PCR实验流程及所需试剂耗材介绍 [兼容模式]

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1、荧光定量PCR实验流程及所需试剂耗材介绍南京润亚宗雅冬2012年5月30日星期三•实验流程：•一、RNA的提取•二、反转录（RT-PCR）•三、荧光定量PCR（qPCR）•四、数据分析•实验注意事项：一、RNA的提取实验方法：异硫氰酸胍-酚-氯仿（三试剂）单步总RNA提取方法——Trizol法实验所需试剂：推荐BIO-RAD的AurumTM基于膜总RNA试剂盒或PureZolTMRNA分离试剂AurumTM总RNA小型试剂盒PureZolTMRNA分离试剂可以从广泛的样本，如培养细胞、细菌、酵母PureZolT

2、MRNA分离试剂操作是Chomczynski动物和植物组织中，提取无DNA污染的总RNA。试和Sacchi的快速、广泛使用的有效RNA分离方法基剂盒采用严格配比的含有异硫氰酸胍和巯基乙醇的试础上改进而得。PureZolTMRNA分离试剂是一种剂，高效裂解样品并快速灭活RNA酶，然后通过离心苯酚和促溶剂异硫氰酸胍的液相混合物，简单的或抽真空对离心柱硅质膜上的RNA进行纯化。这个试一步法就可以高效地完成细胞和组织溶解、去除剂盒也可以用于RNA净化和脱盐。RNA蛋白和灭活的内源核酸酶。DNA和蛋白通过液相分层，有效地

3、与RNA分离。形式：小柱过滤（抽真空或离心）形式：单一有机溶液分离方法：硅质膜分离方法：有机提取*RNA提取实验结束后，请验证RNA的纯度和完整性：1、OD/OD=1.8～2.0，表示RNA质量好，没有蛋白和苯酚的污染。2602802、通过琼脂糖凝胶电泳来验证RNA是否降解二、反转录实验所需试剂：推荐BIO-RADiScriptcDNASynthesisKit该试剂盒组成优化好的5×iScript反应混合液Mix除RNA模板以外所需所有成分的反转录酶混合液缓冲液纯化的iScriptRNaseH加MMLV反转录酶

4、Oligo(dT)防止RNA模板非选择性降解的RNase抑制剂随机引物dNTP稳定剂和增强剂iScriptcDNA合成试剂盒的特点★试剂中既有oligo(dT)，也有随机引物——保证各种RNA模板均能正常反应★预混的优化好的组分——使操作非常便捷，减少了交叉污染，也减少了操作误差，节约了时间★优化的反应条件，高的反转录效率，宽的RNA模板范围——100fg-1ug★带有高活性的iScriptRNaseH+MMLV反转录酶和用于保护RNA模板的RNase抑制剂，满足不同用户需求★Sensitivedetectio

5、nfrom1pgto1mgofinputRNAiScriptcDNA合成试剂盒——试剂成分比较iScriptcDNASynthesisKit，BIO-RADSuperScriptIIFirst-StrandSynthesisSystemforRT-PCR,InvitrogenToa0.2-mltubeadd:Toa0.2-mltubeadd:0.5uloligo(dT),500mg/ml12-184ul5XcDNASynthesisSystem0.5ulRandomhexamers,50ng/ml1uliScr

6、iptenzymemix2ul10Xbuffer4ul25mMMgClxulnuclease-freewater2xulRNAsample1ul10mMdNTP20ulfinalvolume2ul0.1MDTT1ulRNaseOUT(40U/ml)1ulSuperScriptIIRT(50U/ml)xulDEPC-treatedwaterxulRNAsample20ulfinalvolumeiScriptcDNA合成试剂盒——Protocol比较iScriptcDNASynthesisKitSuperScrip

7、tIIFirst-StrandSynthesisSystemforRT-PCR,Invitrogen5minat25oC5minat65oC30minat42oCQuickchillonice5minat85oCAddmoreitemsHoldat4oCMixandincubatefor2minat42oCAddSuperScriptenzymeTotaltime:45minutesIncubatefor50minat42oCHeatkill15minat70oCWithiScript–justset-upth

8、ethermalcyclerandwalkaway!Totaltime:85to90minutesWithSuperScript,you’retiedtothebenchANDyou’llbewaitingforyourcDNAlonger!市面上几款反转录试剂对比ProtocolTimeComparisonBio-RadQuantaInvitrogenInvitrogenABIStr