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1、中国卫生检验杂志2008年9月第18卷第9期ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology,Sep2008;Vol18No91927综述Pyrosequencing技术在病原微生物检测中的应用李秀娟,徐保红,田会方(石家庄市疾病预防控制中心,石家庄050011)[关键词]Pyrosequencing技术;病原微生物;检测[中图分类号]R372[文献标识码]A[文章编号]1004-8685(2008)09-1927-03[3]随着现代科学技术的
2、发展,传统的依靠分离细菌来鉴定自瑞典Linkoping大学医院的两位学者Jonasson与OlofssonTM病原微生物的方法,已远远不能满足对现代各种病原微生物基于Pyrosequencing技术,通过对各种细菌16SrRNA可变区的诊断以及流行病学研究的需要。人们希望对病原体的检验V1及V3的短序列分析,成功分辨了多种细菌。仅仅通过对方法能够更加快速、准确无误,且检测通量更高,人为影响因V1区10bp的片段的分析,就可以快速分辨出数十种细菌。[4]素尽可能减少。而通常的PCR检测方法和实时荧光定量PCRMons
3、teinH等用焦磷酸测序技术检测幽门螺旋杆菌(He方法虽然可达到快速、高通量的目的,但却无法获得分子诊断lieobacterpylori)16SrRNA基因(16SrDNA)易变的V1和V3区的黄金标准-基因序列,从而可能造成假阳性的结果。而利序列,将胃镜活检标本中得到的23个幽门螺旋杆菌标本依据用常规的Sanger测序法仅在对大片段DNA进行序列测定时其V1区(第75~100)的核苷酸序列差异,鉴定出6种不同的才显示出优势,且速度慢、成本高、通量低。但在实际工作中,等位基因类型,除11个样本与幽门螺旋杆菌266
4、95株序列一如果引物对选择得好,很短的一段保守/特异序列的测定就可致,1个样本与J99株的序列一致外,根据V1区的改变表现为[1]满足对病原体分子诊断的需要,如何在很短的时间内,既方有1个或2个核苷酸的突变或单个核苷酸的插入而分为4个便又快速的对短片段进行准确序列测定一直是科研工作者探等位基因类型。另有2个标本的V3区(第990~1020)出现C索研究的问题。至T转换,证明此技术可满足对临床病原菌标本的快速鉴定Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术是在1987年发明的一和分型。瑞典UppsalaUniver
5、sity的StormM等[5]利用焦磷酸项新一代DNA序列分析技术,是由4种酶催化的同一反应体测序技术建立了新的鉴定炭疽热细菌(Bacillusanthracis)及其系中的酶级联化学发光反应。在每一轮测序反应中,只加入致病状态的方法,他们利用此技术分析染色体上的Ba813基一种dNTP,若该dNTP与模板配对,聚合酶就可以将其掺入到因20bp的特异序列来鉴定炭疽热细菌,准确率达996%。引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终通过分析菌株是否含有两个质粒(鉴定pXO1的lef基因和TM转化为
6、可见光信号,并由Pyrogram转化为一个峰值。每个峰pXO2的cap基因)来确定炭疽细菌的致病状态,准确率达值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一[6]100%。Unnerstad等利用焦磷酸测序技术对106株不同血种dNTP,继续DNA链的合成。清型的单核细胞增生李斯特氏菌(Listefiamonoeytogenes)进行Pyrosequencing技术可以快速、准确、实时地进行短DNA了分型,根据inIB基因的第1575位和1578位核苷酸的变化,序列分析,检测通量高,可以同时进行多达96份样品
7、的测序,将血清型1/2a和I/2c分为一组,1/2b和3b分为一组,而血清无需进行电泳,DNA片断也无需荧光标记,操作简单方便,可型4b又可分为2个组。fliC和fljB基因分别决定沙门菌的1程序化,便于构建标准化操作流程和规范,很好的保证实验结相和2相,rfb基因编码O抗原合成的主要酶,二者结合组成了[7]果的稳定性和准确性。目前该技术已广泛应用于微生物的鉴沙门菌的抗原性,用于沙门菌的鉴定。MortimerCK等采用定和分型、耐药性检测、法医学鉴定、遗传学分析、SNP分析、甲焦磷酸测序的方法对FliC基因的序列和
8、变异特征进行了研基化分析及药物基因组学等方面的研究。尤其在微生物鉴究,发现研究所用的100株沙门菌是由29个不同的H1等位[8]定、分型及耐药方面的应用,充分显示出了该技术的优势,本基因组成。DiggleMA等通过扩增和焦磷酸测序分析脑膜炎文将就焦磷酸测序技术在病原微生物检测中的应用作一综萘瑟(氏)菌的4种亚型(B,C,Y,andW135)的siaD,por
